Aislamiento y cultivo de células primarias de Müller en la retina de ratas Sprague-Dawley (SD)

Este protocolo describe el aislamiento y el cultivo de células primarias de Muller de la retina de ratas SD Sprague-Dawley, lo que puede ayudar a la investigación de la retina en la comunidad científica. El protocolo cubre la disección de la retina, la extracción e identificación de IC y las consideraciones clave de control. Este protocolo establece un método eficaz, estandarizado y costoso para extraer y recuperar RMC de sus racks SD legales. El modelo RMC se puede utilizar para simular condiciones patológicas como la diabetes, la normalidad y para ayudar a los efectos de los medicamentos.

[Narrador] Para comenzar, vierta la solución de D-Hank en dos placas de cultivo de vidrio de 10 centímetros. Después de sacrificar y desinfectar la rata SD neonatal, colóquela en un plato curvo estéril. Con unas pinzas dentales, rasgue la piel del párpado a lo largo de la fisura palpebral para exponer el globo ocular de la rata. Mantenga las pinzas desdentadas abiertas y paralelas a la fisura palpebral para presionar hacia abajo el orbitario. Una vez alcanzado el nervio óptico y expuesto el globo ocular, cierre las pinzas para levantar y extraer el globo ocular. Ahora coloque el globo ocular en una placa de cultivo de vidrio con la solución de D-Hank. Enjuague el globo ocular y transfiéralo a otro plato con la solución fresca de D-Hank. Luego, con micropinzas oftálmicas curvas, fije suavemente la región entre la córnea y el nervio óptico para exponer la córnea. Perfore la unión escleral de la córnea con unas microtijeras corneales y corte a lo largo del limbo de forma circular. Haga dos incisiones esclerales simétricas de aproximadamente dos milímetros de longitud antes de soltar las pinzas y sujetarlas en la unión del nervio óptico y la esclerótica. Luego, use un segundo fórceps para presionar suavemente cerca de la raíz del nervio óptico dirigiendo la presión hacia la interfaz del nervio óptico corneal. Cuando aparezca el tejido del cristalino, retírelo con cuidado y continúe presionando hasta que emerja el tejido de la retina. Con fórceps, transfiera el tejido retiniano separado a otra placa de cultivo estéril. Abra la tapa de la placa de cultivo y use una pipeta con una punta de un mililitro para pipetear el tejido de la retina hacia arriba y hacia abajo unas 15 veces para romperlo en pedazos pequeños. Luego, incube el tejido con un mililitro de tripsina al 0,25% a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Retire la placa de cultivo de la incubadora y colóquela en el banco limpio. Agregue dos mililitros de medio completo y pipetee suavemente para detener la digestión. Ahora filtre la suspensión celular a través de una pantalla de nailon de malla 300 en una centrífuga de 15 mililitros dos. Lave la placa de cultivo con PBS preparado y recoja la suspensión restante. Luego gire el tubo a 878 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, aspire y deseche el sobrenadante. Volver a suspender el pellet en dos mililitros de medio completo y centrifugar de nuevo a 878 G durante cinco minutos para purificar las células. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender las células en dos mililitros de medio completo. Tome un matraz T25 con tres mililitros de medio completo y agregue un mililitro de la suspensión celular. Agite el matraz en forma de cruz antes de colocarlo en la incubadora. Después de 48 horas de incubación, retire el matraz de la incubadora y colóquelo en el banco limpio. Deseche el medio gastado y lave la superficie adherida a la célula tres veces con un mililitro de PBS, que contiene un 1% de penicilina más estreptomicina. Luego agregue cinco mililitros de medio fresco y completo, y continúe la incubación hasta que la confluencia celular supere el 90%. Lave las células tres veces con un mililitro de PBS que contenga penicilina estreptomicina al 1%. Luego incube las células con un mililitro de solución de tripsina EDTA al 0,25% durante un minuto y 30 segundos. Ahora, observe el matraz bajo un microscopio invertido. Cuando las células parezcan redondas, desprendidas y comiencen a flotar, agregue dos mililitros de medio de cultivo completo al matraz para terminar la digestión. A continuación, utilice una pipeta para aspirar la suspensión celular y transfiera toda la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Enjuague la pared del matraz con dos mililitros de PBS que contengan penicilina estreptomicina al 1% y agréguelo al mismo tubo. Centrifugar el tubo a 878 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en un volumen apropiado de medio completo. Finalmente, pase las celdas en una proporción de uno a dos o de uno a tres, según sea necesario. Las células de Muller retinianas de segundo paso o RMC mostraron morfologías en forma de estrella o de huso con núcleos redondos u ovalados y abundante citoplasma. La tinción con hematoxilina y eosina reveló células fusiformes y en forma de estrella con abundante citoplasma rosado y núcleos ovalados ubicados en el centro interconectados por finas estructuras filamentosas. La tinción de inmunofluorescencia de las RMC reveló una fuerte fluorescencia roja en las células marcadas para glutamina sintetasa y acuaporina-4 y fluorescencia verde brillante para CRALBP, Kir4.1 y vimentina. NeuN, el control negativo no se detectó en el análisis de inmunofluorescencia, lo que confirma la especificidad del aislamiento de RMC. El análisis de citometría de flujo mostró que el 98,7% de las células eran positivas para glutamina sintetasa y el 97% eran positivas para CRALBP, lo que indica una alta pureza de las RMC.