Extracción de ADN basada en matrices para la secuenciación dirigida de próxima generación en muestras de esputo descontaminadas

Nuestra investigación trata de reducir el tiempo de respuesta del diagnóstico de TB y el posterior inicio mediante la incorporación de NGS para la atención personalizada del paciente. Nuestro protocolo optimiza TNGS para uso rutinario al abordar la integración del flujo de trabajo, el costo y el tiempo de respuesta, con el objetivo de reducir los retrasos en el diagnóstico y mejorar el inicio oportuno del tratamiento.

Este protocolo permite una extracción de ADN rentable, rápida y de calidad suficiente de muestras clínicas en cuestión de horas en comparación con los métodos CTAB convencionales, que tardan hasta tres días.

Nuestros resultados plantean preguntas clave sobre la integración de TNGS en el diagnóstico de rutina y la optimización de los métodos de extracción para muestras escasas y negativas para mejorar la sensibilidad y la utilidad clínica. Exploraremos si las muestras remanentes de los diagnósticos de rutina se pueden utilizar para la secuenciación posterior, incluida la secuenciación directa del genoma completo del esputo para agilizar y expandir la vigilancia genómica de la tuberculosis.

[Narrador] Para comenzar, obtenga un sedimento de esputo inactivado por calor. Centrifugar la muestra a 16.800 G, o a velocidad máxima durante 15 minutos. Con una pipeta de 20 a 200 microlitros, aspire suavemente y deseche el sobrenadante, asegurándose de que el gránulo permanezca intacto. Agite suavemente la suspensión de la matriz para mezclar, luego pipetee 200 microlitros de la matriz bien mezclada para volver a suspender el gránulo. Transfiera todo el volumen a un tubo con tapón de rosca de 1,5 mililitros que contenga tres perlas de vidrio preesterilizadas de dos milímetros de diámetro. Ahora, coloque las muestras en un bloque calefactor a 56 grados centígrados durante 15 minutos. Después de la incubación, homogeneice las muestras con un vórtice durante 10 segundos para dispersar las células, luego incube las muestras en un bloque de calentamiento a 100 grados centígrados durante 10 minutos. Homogeneice las muestras utilizando un homogeneizador de alta velocidad con un ciclo de 60 segundos a 4,0 metros por segundo. A continuación, centrifugar la suspensión a 12.000 G durante cinco minutos. Transfiera 130 microlitros del sobrenadante que contiene ADN a un tubo fresco de baja unión de 1,5 mililitros sin alterar el gránulo. Deseche el primer tubo que contiene la matriz y los restos celulares. Para purificar el ADN usando perlas magnéticas, primero haga un vórtice con la botella de stock de perlas magnéticas o prepare una alícuota a fondo para volver a suspender las perlas antes de usarlas, luego agregue 1,2 veces el volumen de perlas magnéticas al ADN extraído, pipetee la suspensión 10 veces para mezclar las muestras antes de incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Coloque las muestras en una gradilla magnética de tubo de 1,5 mililitros durante tres minutos, o hasta que el líquido se aclare, luego aspire con cuidado y deseche el sobrenadante sin alterar las perlas. Con los tubos en el imán, agregue 200 microlitros de etanol al 80%, asegurándose de que las perlas permanezcan intactas. Después de una incubación de 30 segundos, aspire y deseche cuidadosamente el etanol sin alterar las perlas. Después del segundo lavado, elimine el etanol residual con una pipeta de uno a 10 microlitros. Deja los tubos abiertos para secar al aire las perlas durante 10 minutos o hasta que tengan un aspecto mate. Una vez que las perlas tengan un aspecto mate, retire los tubos del imán y agregue 50 microlitros de agua libre de nucleasas directamente sobre las perlas en cada muestra. A continuación, mezcle cada muestra individual pipeteando 10 veces. Inspeccione el tubo en busca de cuentas atascadas en el interior. Después de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética durante tres minutos o hasta que el líquido esté claro. Con los tubos en la gradilla magnética, transfiera el sobrenadante que contiene ADN a un tubo estéril de baja unión claramente marcado. La concentración de ADN fue mayor en muestras de sedimentos de dos mililitros, en comparación con 500 microlitros en todos los grados de frotis. Se observó una mayor variabilidad en el rendimiento de ADN en muestras de sedimentos de 500 microlitros. La profundidad de cobertura de las lecturas de secuenciación fue mayor en muestras de sedimentos de dos mililitros en comparación con 500 microlitros en todos los grados de frotis. La variabilidad fue mayor en tres muestras de grado de frotis extraídas de sedimentos de 500 microlitros. Los puntajes de aceptabilidad de secuenciación fueron generalmente más altos en muestras de dos mililitros en comparación con 500 microlitros, con una mayor proporción de resultados altamente aceptables. Las muestras de frotis de grado tres plus tuvieron la mayor proporción de resultados aceptables, en comparación con los grados de frotis uno plus y dos plus. Las muestras de 500 microlitros tuvieron más casos clasificados como inaceptables o no determinados.