Establecimiento y análisis histológico de organoides esofágicos que modelan la progresión de tejidos normales a cancerosos

Nuestra investigación se centra en el inicio del tumor y la tumorigénesis temprana. Examinamos cómo las células normales se transforman en células tumorales y cómo estas células modifican su microambiente para facilitar la tumorigénesis. En la actualidad, hay muchas tecnologías utilizadas para promover la investigación, incluidas las tecnologías de células madre, las tecnologías de edición de genes, el sistema avanzado de cultivo 3D y los biomateriales y las tecnologías ómicas unicelulares y espaciales. El mayor desafío al que nos enfrentamos es mantener los organoides libres de bacterias y hongos. Estos contaminantes se cuelan durante la manipulación y el transporte de tejidos, a menudo arruinando nuestros cultivos.

[Instructor] Para comenzar, descongele la matriz de la membrana basal y el medio de cultivo de organoides esofágicos humanos a cuatro grados centígrados. Transfiera la muestra de tejido a tubos de centrífuga de cinco mililitros, luego lave la muestra tres veces con tampón de lavado a temperatura ambiente. Con unas tijeras estériles, pique el tejido en fragmentos de un milímetro en cubos en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros. Ahora, suspenda los fragmentos de tejido en un mililitro de tampón de digestión. Agite la mezcla a 37 grados centígrados a 50 a 100 revoluciones por minuto durante 10 a 20 minutos para digerir el tejido. A continuación, centrifugar la mezcla a 400G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tripsina-EDTA al 0,025%. Incube la suspensión a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Luego agregue un mililitro de DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10% para detener la actividad enzimática. A continuación, pase la suspensión a través de un filtro estéril de 70 micrómetros y recoja el filtrado en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Centrifugar el filtrado durante cinco minutos a 400G a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender las células en 100 microlitros de H-EOCM después de desechar el sobrenadante. Después de volver a suspender las celdas, determine la densidad celular mediante un contador de celdas. Luego transfiera de 5,000 a 15,000 células por mililitro a un tubo nuevo de 1.5 mililitros. Para la siembra de organoides, vuelva a suspender suavemente las células en 50 a 100 microlitros de matriz de membrana basal. Pipetear 50 microlitros de la mezcla de células de matriz en el centro de cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos para polimerizar la matriz de la membrana basal. Ahora pipetea 500 microlitros de H-EOCM precalentado a cada pocillo para cubrir la matriz. Luego incube la placa en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Para reemplazar el medio, aspire el medio gastado. Reponga cada pocillo con 500 microlitros de H-EOCM fresco precalentado a 37 grados centígrados. Realizar tinción de inmunofluorescencia multiplex en organoides redesafinados y rehidratados. Agregue una solución bloqueadora de suero de oveja para cubrir los organoides en un portaobjetos colocado en una cámara de humedad e incube el portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lave el portaobjetos con Tween que contiene PBS durante dos minutos. A continuación, deje caer el anticuerpo primario diluido para cubrir el área del organoide. Incubar en una cámara de humedad de acuerdo con los requisitos de anticuerpos. Después de la incubación, lave los portaobjetos en PBS-T dos veces durante dos minutos a 80 PMM en una cámara termoestable. Ahora deje caer una solución de anticuerpos secundarios en el área del organoide e incube en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de la incubación, lave los portaobjetos en PBS-T dos veces durante dos minutos a 80 RPM en una cámara termoestable. Pipetee la solución de tinte fluorescente sobre el portaobjetos lavado para cubrir el área del organoide e incubar nuevamente. Después de la incubación, lave los portaobjetos en PBS-T dos veces. Para la multitinción, repita la recuperación de antígenos y el bloqueo de anticuerpos. Luego deje caer una solución húmeda para cubrir el área del organoide. Sumerja los portaobjetos en agua esterilizada durante dos minutos para eliminar el exceso de mancha. Agregue un medio de montaje antidecoloración y aplique un cubreobjetos antes de adquirir imágenes digitales. Las estructuras organoides se desorganizaron cada vez más de las etapas normales a las del carcinoma, como se visualiza mediante la tinción de KRT6A. La expresión de PDL1 aumentó progresivamente de la mucosa esofágica normal al carcinoma de células escamosas de esófago.