En la cara Crioseccionamiento de retina de ratón para análisis molecular espacial de alta dimensión

La retina es un modelo útil para comprender los cálculos neuronales. Estos cálculos dependen de las posiciones especiales de las celdas. Sin embargo, los mapas completos de esto han seguido siendo difíciles de alcanzar.

Durante la última década, la secuenciación de células individuales proporcionó descripciones claras de los tipos de células de la retina. Ahora, la transcriptómica espacial proporciona una forma novedosa de usar estas descripciones en tejido intacto. Un desafío crítico para el uso de la transcriptómica espacial es que requieren secciones de tejido muy delgadas. La retina ya es bastante delgada en el plano horizontal que nos interesa.

Al inventar este método para crear secciones delgadas y rápidas, utilizar la transcriptómica espacial en el aprendizaje automático para mapear todas las células ganglionares de la retina en el mismo tejido. En los últimos 30 años, solo se mapearon 17 de las 45 células ganglionares de la retina de los ratones, y esta técnica nos permitió mapearlas todas a la vez.

[Instructor] Para comenzar, coloque un ratón sacrificado en la mesa de trabajo. Pasó el polo temporal del globo sobre la córnea para mantener la orientación y crear un punto débil para la disección. Sumerja el globo terráqueo y apunte la solución en un plato que contenga un trozo de papel de filtro. Con fórceps afilados número cinco y tijeras de iris, retire con cuidado toda la musculatura, fascia, vasculatura y nervios del globo sin perforar la esclerótica. Coloque la punta de una hoja de tijera Iris perpendicular a la marca de la córnea. Perfora el globo en esta posición. Haga una sola incisión limpia a través de la córnea y el limbo, continuando hacia la esclerótica y la retina hacia la cabeza del nervio óptico. Luego coloque la cuchilla perpendicular al corte inicial, aproximadamente un milímetro posterior al limbo. Comience a cortar radialmente a través de la esclerótica y la retina. Mantenga una línea de corte consistente posterior y paralela al limbo mediante el uso de pinzas afiladas para guiar y rotar el globo. Si la retina y la esclerótica se separan, vuelva a colocar la hoja de la tijera Iris para cortarlas juntas. Calcule la distancia posterior de un milímetro usando el ancho medio de la hoja de tijera Iris Después de completar el corte radial paralelo al limbo, inspeccione las conexiones retinianas restantes. Córtelos cuidadosamente con tijeras Iris hasta que las secciones del globo anterior y posterior estén separadas. A continuación, use dos pares de fórceps afilados número cinco para separar suavemente las partes anterior y posterior del globo. En ratones más viejos, si las fibras transparentes conectan el cristalino a la copa de la retina, córtelas cuidadosamente con tijeras Iris mientras minimiza la separación escleral de la retina. Usando el papel de filtro como plataforma de soporte, corte la retina en una hoja de trébol, también llamada patrón de cruz de hierro con tijeras Iris. Repita la disección con el segundo ojo. Corte la punta de una pipeta de transferencia de plástico desechable para crear una abertura más grande que la retina y la esclerótica disecadas. Succiona suavemente la retina en la pipeta y deposítala en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Con una toallita de laboratorio, elimine el exceso de solución de puntería hasta que la retina ya no flote y se pueda aplanar. Ahora use dos fórceps afilados número cinco para desplegar la retina y colóquela plana con la copa interna del ojo hacia arriba. Haga cortes de alivio de 0.5 a dos milímetros de largo en cada segmento de alivio de trébol para ayudar a aplanar y ajustar para evitar que se doble. Retire cualquier resto de solución AI, excepto el líquido adyacente a la retina. Con un cubreobjetos, presione y transfiera rápidamente la retina para que la esclerótica externa mire hacia arriba y el ocular interno esté en contacto con el cubreobjetos. Verifique que la retina no esté doblada y haga ajustes si es necesario. Agregue una solución de puntería para ayudar a la manipulación, pero elimine el exceso con una toallita para evitar que se enrolle y deje que se seque al aire durante cinco a 10 segundos. Ahora aplique medio OCT para cubrir la retina. Luego use fórceps para distribuir uniformemente la capa a través del cubreobjetos para evitar la flotación. Congele rápidamente la retina en medio OCT utilizando una placa de metal enfriada con vapor de nitrógeno líquido o entrando en contacto directamente con hielo seco. Guarde la retina congelada en hielo seco para su uso inmediato. Para la criosección, cree una cúpula OCT en el mandril de muestras, ocupando los dos o tres anillos internos si se usa el mismo modelo de criostato. Alinee el portamuestras plano con la superficie de corte. Cree o anote la guía de orientación que relaciona el mandril con la etapa de criostato. Luego recorte la cúpula para formar una superficie plana paralela a la hoja. Con una cuchilla de afeitar, elimine el exceso de OCT lateralmente y separe cuidadosamente la retina del cubreobjetos para que sea móvil. Retire el mandril de la platina y aplique una pequeña gota de OCT líquido a la superficie plana de OCT preparada. A continuación, coloque la retina directamente sobre la OCT líquida. Use un portaobjetos de vidrio preenfriado para presionar y sostener la retina hasta que se congele. Aplique más OCT sobre la retina y el mandril para asegurar la unión. Luego congele el conjunto en el área de congelación rápida de criostato. Para la sección, recorte cuidadosamente el exceso de OCT hasta que la retina sea visible. Use una cuchilla de afeitar para dar forma a los bordes del bloque OCT cerca de la retina. Continúe recortando mientras inspecciona la presencia de esclerótica. Cuando la esclerótica sea visible, ajuste el ángulo de la platina según sea necesario. Deje de recortar cuando la esclerótica esté distribuida aproximadamente uniformemente en las secciones. Ahora, use diapositivas preenfriadas y dos pinceles para manipular las secciones y recogerlas. Coloque un dedo debajo de la sección durante unos cinco segundos hasta que la OCT se derrita y adhiera el tejido al portaobjetos. Luego regrese el portaobjetos a una superficie fría para volver a congelarlo. Guarde los portaobjetos preparados en hielo seco para su uso inmediato. La inmunorreactividad distinta o RBPMS en la capa de células ganglionares y la clara separación de los plexos vasculares marcados por lectina de tomate confirmaron la preservación exitosa de la laminación retiniana y los marcadores proteicos. La detección de ARN multiplex utilizando un panel de endoscopio de ARN de 12 plex mantuvo con éxito la estructura espacial y reveló una expresión distinta de marcadores como Grm6 y RBPMS en el corte de la cara. Las imágenes de alta resolución confirmaron los patrones de expresión de una sola célula para RBPMS y otros marcadores como Mafb6 y Meis2, validando la localización de proteínas y ARN en la capa de células ganglionares. La distribución uniforme de señales en las secciones de hojas de trébol y las señales fuertes en los datos transcriptómicos espaciales de xenio confirmaron el éxito del perfil de alto rendimiento y la integridad del ARN. La visualización de la resolución de una sola celda utilizando patrones de detección manuales coincidentes con xenium confirma la solidez del protocolo en todas las plataformas. Los marcadores de transcripción específicos del tipo de célula mostraron una distribución laminar estratificada en la sección transversal de la retina y en el mapeo facial, preservando su ubicación a través de las profundidades. El zoom detallado en la capa de células ganglionares confirmó la detección precisa de transcripciones espaciales en relación con la tinción nuclear DAPI.