Mejora de la entrega y expresión génica mediante inyección intraósea de nanopartículas de quitosano Encapsulado en plásmidos de base de adenina

Proponemos un método de terapia génica que administra directamente el quitosano Editor a base de adenina a la médula ósea a través de la inyección intraósea. La eficiencia de transfección de plásmidos exógenos en animales de experimentación es relativamente baja y la introducción de plásmidos para la expresión génica a largo plazo puede verse afectada por el sistema inmunológico. Utilizamos el quitosano para encapsular plásmidos editor a base de adenina y administramos directamente el complejo a la médula ósea de ratones mediante inyección intraósea, lo que lo hace adecuado para enfermedades causadas por una función anormal de los osteoclastos.

Nuestro protocolo ofrece una alta eficiencia de transfección, un pequeño daño biológico y una alta eficiencia de expresión génica. Nuestra novedosa estrategia no solo es adecuada para enfermedades causadas por una función anormal de los osteoclastos, sino que también tiene un potencial significativo para avanzar en el campo de la terapia génica. Para comenzar, coloque un ratón sacrificado en una mesa de trabajo.

Con unas tijeras quirúrgicas y unas pinzas, retire la tibia y elimine todo el tejido muscular circundante. Remoje la tibia limpia en PBS y lave hasta que solo quede el hueso. Extraiga un mililitro de PBS en una jeringa y enjuague las células de la médula ósea de un extremo de la tibia hasta que el hueso se vuelva completamente blanco.

A continuación, recoja la suspensión celular en un tubo. Centrifugarlo a 800 G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de pipetear el sobrenadante, agregue 500 microlitros de tampón de lisis de glóbulos rojos al sedimento.

Después de un minuto, agregue un mililitro de tampón de separación para terminar la lisis. Centrifugar la suspensión nuevamente a 800 G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y coloque el gránulo celular resultante en hielo para su uso posterior.

Para la transfección de quitosano, disuelva cuatro miligramos de quitosano en 20 mililitros de solución de ácido acético. Ajuste el pH a 5.5 usando hidróxido de sodio 10 molar. Luego dispense 500 microlitros de la solución de quitosano en tubos de microcentrífuga individuales.

Ahora agregue dos, tres, cuatro y cinco microgramos de plásmidos ABE en tubos individuales. Disuelva los plásmidos en 500 microlitros de sulfato de sodio de 30 milimolares. Luego mezcle 500 microlitros de solución plásmida con 500 microlitros de solución de quitosano en los tubos correspondientes.

Incube los tubos en un baño de agua a 50 a 55 grados centígrados durante 15 minutos. Agite cada tubo durante 15 a 30 segundos y déjelos reposar sin tocarlos durante 30 minutos. Para la caracterización, analice el diámetro y el potencial zeta del quitosano utilizando la dispersión dinámica de la luz.

Mantenga la concentración de quitosano en 0,1 miligramos por mililitro en agua destilada doble. A continuación, arroje muestras de quitosano de 0,1 miligramos por mililitro en un chip de silicio. Agregue 20 microlitros de las muestras resuspendidas en 200 rejillas de malla e incube.

Centrifugar la suspensión de células de médula ósea a 800 G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante, luego agregue 500 microlitros de lisado de glóbulos rojos. Después de un minuto, agregue un mililitro de tampón de separación para detener la reacción.

Luego cuente el número de celdas con un contador de celdas. A continuación, transfiera 1 millón de células a un nuevo tubo de microcentrífuga. Después de centrifugar nuevamente, pipetee el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de PBS.

Transfiera las células resuspendidas a un tubo de citometría de flujo y mida la eficiencia de la transfección mediante citometría de flujo. Para la inyección en la cavidad de la médula ósea, fije el ratón anestesiado en posición supina sobre la mesa de operaciones. Use cinta adhesiva para asegurar la extremidad delantera en su lugar.

Desinfecte la tibia posterior con un hisopo con alcohol. Luego cargue la solución plasmídica en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26. Retire las burbujas de aire y mantenga la jeringa lista para la inyección.

A continuación, toque y estabilice la espinilla del mouse con los dedos. Coloque la aguja de inyección para ingresar al eje tibial desde la meseta tibial cerca de la articulación de la rodilla. Ahora gire la aguja paralela a la tibia, insértela en la cavidad de la médula ósea e inyecte lentamente durante tres segundos.

Después de la inyección, retire lentamente la aguja durante tres segundos. Desinfecte inmediatamente el sitio de punción con un hisopo con alcohol para detener cualquier sangrado. Coloca el ratón en un ambiente cálido a 37 grados centígrados para facilitar su recuperación.

Las nanopartículas formadas con los plásmidos ABE y GRNA tenían una morfología esférica uniforme y una distribución de tamaño estrecha con un tamaño promedio de 202,9 nanómetros. Un potencial zeta de 2,77 milivoltios y un índice de polidispersión de 0,22. El plásmido ABE incrustado en quitosano mejoró significativamente la señal fluorescente en las células de la médula ósea, lo que indica una mayor eficiencia de transfección en comparación con el grupo de control.

La citometría de flujo confirmó que el plásmido ABE codificado con quitosano logró una alta eficiencia de transfección en las células de la médula ósea. Con una eficiencia máxima del 51,2% observada a una dosis de cuatro microgramos, mientras que tres microgramos proporcionaron un equilibrio de alta eficiencia del 47,2%, la secuenciación de Sanger y la PCR del ADN genómico de células de médula ósea revelaron la edición de genes in vivo en el sitio diana A1 con una eficiencia del 14,27% y en el sitio A2 con una eficiencia del 10,69%.