Name: Ensayo inmunoquímico validado para la determinación completa del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano liberado y unido a las células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprende un ensayo ELISA sandwich validado para cuantificar HER2 unido y liberado en células cultivadas y muestras de pacientes. Este método mejora el diagnóstico y monitoreo del cáncer.

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1. Cultivo de células cancerosas humanas
<ol><li>Cultivo de las líneas MDA-MB-231, SK-BR-3 y SK-OV-3 en el medio Modified Eagle de Dulbecco que contiene 4,5 g/L de ᴅ-glucosa (DMEM-HG), suplementado con 2 mM de ʟ-glutamina y 10% (v/v) de FBS inactivado por calor. Incubar los cultivos a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.</li>
	<li>Cuando el cultivo alcance ~80% de confluencia, separe las células por tripsinización y recójalas en tubos cónicos separados de 15 mL.</li>
	<li>Cuente las células con un contador automático de células y las células semilla para el experimento en placas de 12 pocillos a una densidad de 3 × 105 células/pocillo en 1 mL de medio de crecimiento. Incubar los cultivos a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2. NOTA: Siembre un pocillo por cada punto de tiempo del experimento. Tanto el medio de postcultivo como los lisados celulares se utilizarán en análisis posteriores.</li>
</ol>2. Recogida y preparación de muestras
<ol><li>A partir del cultivo de 24 h, recoja el medio de cultivo de un pocillo de cada línea celular en un tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar las muestras recogidas a 10 000 × g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y guárdelo a -20 °C para determinar aún más el nivel de ECD HER2 secretado.</li>
	<li>Lave las células restantes de la placa con 1 ml de PBS frío, aspire suavemente y deseche el PBS.</li>
	<li>Añadir 200 μL de tampón RIPA (suplementado con un 1% de inhibidor de la proteasa) en cada pocillo e incubar durante 5 min. Raspar las células con el raspador de células y mezclar pipeteando varias veces para homogeneizar el lisado.</li>
	<li>Recoja las células lisadas en un tubo nuevo y aspire lentamente en una jeringa de 2 ml con una aguja (G21 / 0,8 mm × 40 mm). Repita el paso de aspiración de 5 a 10 veces para desintegrar aún más las células.</li>
	<li>Centrifugar las muestras recogidas a 10 000 x g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y guárdelo a -20 °C para una mayor determinación de la fracción de la proteína HER2 unida a la célula.</li>
	<li>Repita la recolección del medio de cultivo y los materiales celulares, siguiendo los pasos de preparación para los puntos de tiempo restantes: 48 h y 72 h de cultivo.</li>
</ol>3. Realización de un ELISA sándwich para la determinación de HER2
<ol><li>Prepare los tampones.<ol><li>Tampón de recubrimiento: Prepare una solución de NaHCO3 de 0,1 M disolviendo 0,42 g de NaHCO3 en 50 ml de agua destilada y mezcle bien. Ajuste el pH a 9,6 con 3 M de NaOH.</li>
		<li>Tampón de bloqueo: Prepare leche de vaca descremada al 5% (NFDM) en PBS agregando 0,5 g de leche secante en polvo a 10 ml de PBS y mezcle bien.</li>
		<li>Tampón de lavado: Prepare solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 (PBST) agregando 0,5 mL de 0,05% Tween-20 a 1000 mL de PBS y mezcle (evite la formación excesiva de espuma).</li>
	</ol></li>
	<li>Biotinilato el anticuerpo detectador.<ol><li>Biotinilato 50-200 μg de anticuerpo anti-HER2 detector (clon 70.21.73.67) utilizando un kit comercial de etiquetado de biotina según las instrucciones del fabricante. NOTA: La fiabilidad y la repetibilidad del proceso de biotinilación se basan en la medición de la concentración final de proteínas del anticuerpo resultante y en la comparación entre lotes del producto.</li>
	</ol></li>
	<li>Cubre el plato.<ol><li>Diluir el anticuerpo capturador anti-HER2 (clon 70.27.58) hasta una concentración de 1 μg/mL en el tampón de recubrimiento. Para recubrir una placa, use 6,5 mL de la solución de anticuerpos capturadores.</li>
		<li>Con una pipeta multicanal, agregue 100 μL de la solución de anticuerpos capturadores (preparada en el paso 3.3.1) a cada pocillo en una placa ELISA de 96 pocillos. NOTA: Evite los pozos más exteriores de la placa (por ejemplo, A1, H12) para reducir la variabilidad causada por el efecto de borde. Los pozos más exteriores deben llenarse con agua destilada para garantizar condiciones de reacción estables.</li>
		<li>Cubra la placa con una película de sellado.</li>
		<li>Incubar la placa durante la noche (O/N) a 4 °C.</li>
		<li>Después de la incubación O/N, coloque la placa a temperatura ambiente (RT) en un agitador de microplacas horizontal (20-30 rpm con un ángulo de inclinación de 4°-6°) durante 1 h.</li>
		<li>Con una lavadora de microplacas, aspire la solución de recubrimiento y lave la placa tres veces con un tampón de lavado (3 x 300 μL de PBST por pocillo).</li>
	</ol></li>
	<li>Bloquee la placa.<ol><li>Con una pipeta multicanal, añada 100 μL de tampón de bloqueo (5% de NFDM en PBS) a cada pocillo recubierto para bloquear los sitios de unión no específicos.</li>
		<li>Cubra la placa con una película de sellado.</li>
		<li>Incubar la placa durante 1 h a 37 °C en una cámara de humedad.</li>
		<li>Con una lavadora de microplacas, aspire la solución de recubrimiento y lave la placa tres veces con un tampón de lavado (3 x 300 μL de PBST por pocillo).</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare una curva de calibración y control positivo (Figura 2).<ol><li>Prepare la solución estándar de trabajo del antígeno HER2 añadiendo 2 μL de 1 mg/mL de solución madre a 1998 μL de PBS para obtener una concentración de HER2 de 0,001 mg/mL (1000 ng/mL).</li>
		<li>Diluir la solución estándar de trabajo (WSS) añadiendo 200 μL de la solución a 1800 μL de PBS para obtener la solución estándar 1 (STD 1).</li>
		<li>Prepare los seis patrones subsiguientes (STD 2-STD 7) mediante diluciones seriadas de STD 1 en PBS (Figura 2).<ol><li>STD 2: Agregue 500 μL de STD 1 a 500 μL de PBS y mezcle bien para preparar 50 ng/mL.</li>
			<li>STD 3: Agregue 500 μL de STD 2 a 500 μL de PBS y mezcle bien para preparar 25 ng/mL.</li>
			<li>STD 4: Agregue 500 μL de STD 3 a 500 μL de PBS y mezcle bien para preparar 12.5 ng/mL.</li>
			<li>STD 5: Agregue 500 μL de STD 4 a 500 μL de PBS y mezcle bien para preparar 6.25 ng/mL.</li>
			<li>STD 6: Agregue 500 μL de STD 5 a 500 μL de PBS y mezcle bien para preparar 3.125 ng/mL.</li>
			<li>STD 7: Agregue 500 μL de STD 6 a 500 μL de PBS y mezcle bien para preparar 1.5625 ng/mL.</li>
			<li>STD 8: Agregue 500 μL de PBS para preparar 0 ng/mL.</li>
		</ol></li>
		<li>Control positivo: Diluir STD 1 añadiendo 100 μL de la solución STD 1 a 900 μL de PBS para obtener una solución de HER2 a una concentración de proteína de 10 ng/mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare muestras para experimentos de picos y recuperación.<ol><li>Prepare las muestras de la matriz (PBS, lisados celulares y medio de cultivo) enriquecidas con la concentración conocida de la proteína HER2. Diluir los lisados celulares 1:2000 añadiendo 2,5 μL de lisado celular apropiado a 5 mL de PBS para adquirir una matriz de muestra con un nivel de HER2 por debajo del LOD del método.</li>
		<li>Utilice WSS (1000 ng/mL) y STD1 (100 ng/mL) para aumentar las muestras de la matriz.</li>
		<li>Para cada matriz, prepare 6 muestras con concentraciones de 0, 2, 5, 10, 30 y 50 ng/mL.</li>
		<li>Para preparar 0 ng/mL, añadir 400 μL de PBS/medio de cultivo/lisado celular.</li>
		<li>Para preparar 2 ng/mL, agregue 8 μL de STD1 a 392 μL de PBS/medio de cultivo/lisado celular y mezcle bien.</li>
		<li>Para preparar 5 ng/mL, agregue 20 μL de STD1 a 380 μL de PBS/medio de cultivo/lisado celular y mezcle bien.</li>
		<li>Para preparar 10 ng/mL, añadir 4 μL de WSS a 396 μL de PBS/medio de cultivo/lisado celular y mezclar bien.</li>
		<li>Para preparar 30 ng/mL, agregue 12 μL de WSS a 388 μL de PBS/medio de cultivo/lisado celular y mezcle bien.</li>
		<li>Para preparar 50 ng/mL, agregue 20 μL de WSS a 380 μL de PBS/medio de cultivo/lisado celular y mezcle bien.</li>
	</ol></li>
	<li>Agregue la muestra, el espacio en blanco y el estándar.<ol><li>Con una pipeta de un solo canal, agregue 100 μL de muestras estándar, en blanco (PBS) y analizadas (lisados celulares y medio de cultivo) a los pocillos apropiados. NOTA: Se recomienda ejecutar cada muestra por triplicado.</li>
		<li>Cubra la placa con una película de sellado.</li>
		<li>Incubar la placa durante 1 h a 37 °C en una cámara de humedad.</li>
		<li>Con una lavadora de microplacas, aspire la solución de recubrimiento y lave la placa tres veces con un tampón de lavado (3 x 300 μL de PBST por pocillo).</li>
	</ol></li>
	<li>Detectar la unión de anticuerpos.<ol><li>Diluir el anticuerpo detector biotinilado (clon 70.21.73.67) en PBS hasta una concentración de trabajo de 1 μg/mL. Para una placa, use 6.5 mL de solución de trabajo de anticuerpos de detección.</li>
		<li>Con una pipeta multicanal, añada 100 μL de la solución de trabajo de anticuerpos de detección a cada pocillo.</li>
		<li>Cubra la placa con una película de sellado.</li>
		<li>Incubar la placa durante 1 h a 37 °C en una cámara de humedad.</li>
		<li>Con una lavadora de microplacas, aspire la solución de recubrimiento y lave la placa tres veces con un tampón de lavado (3 x 300 μL PBST por pocillo).</li>
	</ol></li>
	<li>Añadir conjugado Avidin-HRP.<ol><li>Diluir el conjugado Avidin-HRP disponible en el mercado 1:40.000 añadiendo 1 μL de conjugado enzimático a 40 mL de PBST.</li>
		<li>Con una pipeta multicanal, añada 100 μL del conjugado diluido a cada pocillo.</li>
		<li>Cubra la placa con una película de sellado.</li>
		<li>Incubar la placa durante 1 h a 37 °C en una cámara de humedad.</li>
		<li>Con una lavadora de microplacas, aspire la solución de recubrimiento y lave la placa tres veces con un tampón de lavado (3 x 300 μL de PBST por pocillo).</li>
	</ol></li>
	<li>Reacción colorimétrica<ol><li>Con una pipeta multicanal, agregue 100 μL de sustrato de 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo.</li>
		<li>Cubra la placa con una película de sellado.</li>
		<li>Incubar la placa durante 1-5 min a 37 °C lejos de la luz y controlar el desarrollo del color.</li>
		<li>Cuando el color alcance el nivel esperado, agregue 100 μL de solución de parada para terminar la reacción. NOTA: El nivel esperado corresponde a un color azul intenso en pocillos que contienen muestras con una alta concentración del analito.</li>
	</ol></li>
	<li>Adquirir y analizar datos.<ol><li>Mida la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.</li>
		<li>Usando una curva de calibración de 4 parámetros, calcule la concentración de la muestra en función de la ecuación de la curva.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68204/68204fig1v5.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático del flujo de trabajo ELISA sándwich anti-HER2 desarrollado. Resumen de los pasos clave en el procedimiento ELISA sándwich. Estos incluyen los pasos críticos (resaltados con un marco rojo) como el recubrimiento de la placa con el anticuerpo anti-HER2 de captura 70.27.58, la adición de muestras (patrones de curva, blanco, muestras experimentales de los lisados celulares o medio de cultivo) y la unión del anticuerpo anti-HER2 de detección 70.21.73.67. El ensayo concluye con la detección de señales y el análisis de datos, donde la señal colorimétrica se cuantifica utilizando un lector de microplacas para determinar la concentración del antígeno objetivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68204/68204fig1v5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68204/68204fig02.jpg"> Figura 2: Esquema que presenta la preparación de las soluciones patrón de la curva de calibración. Las diluciones seriadas de la proteína recombinante HER2 se preparan para generar una curva de calibración en un rango de concentración de 1,56-100 ng/mL (viales STD 1-STD 7). Además, se incluye la muestra de control negativa sin la proteína HER2 (STD 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68204/68204fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Kit de etiquetado de biotina-NH2</td><td>Abnova</td><td>KA0003</td><td></td></tr><tr><td>Grado de transferencia, leche en polvo, bajo en grasa</td><td>Roth</td><td>T145.1</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de recuento de células para contador de células TC10 / TC20, placas de</td> cultivo celular <td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td>de doble cámara</tr><tr><td></td><td>Biologix</td><td>07-6012</td><td></td></tr><tr><td>Raspadores de células</td><td>Biologix</td><td>70-1250</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugadora</td><td>Ohaus</td><td>30130868</td><td></td></tr><tr><td>Clase II Gabinete de Seguridad Biológica - Telstar Bio II Advance 6</td><td>Telstar</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Placas transparentes de fondo plano de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>Incubadoras seguras para cultivos de CO2 - Touch 190S</td><td>Leec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - alto contenido de glucosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0822</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas ELISA</td><td>BioTek</td><td>800TSUVI</td><td></td></tr><tr><td>FBS Standard, suero fetal bovino</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-19375</td><td></td></tr><tr><td>Secador de laboratorio de circulación forzada</td><td>BINDER</td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>HRP-Avidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>43-4423</td><td></td></tr><tr><td>Proteína humana Her2 / ErbB2, etiqueta Fc, grado premium</td><td>AcroBIOSYSTEMS</td><td>HER2-H5253</td><td></td></tr><tr><td>Lavadora de microplacas</td><td>Immunowash Bio-Rad</td><td>170-7009</td><td></td></tr><tr><td>Solución de L-glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>mAb a-HER2 (clon 70.21.73.67)</td><td>SDS Optic</td><td>BIO-ABH-2</td><td></td></tr><tr><td>mAb a-HER2 (clon 70.27.58)</td><td>SDS Optic</td><td>BIO-ABH-1</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Línea celular</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>POCH</td><td>810530115</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>POCH</td><td>BA0981118</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel inhibidor de la proteasa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Fair PBS</td><td>Roth</td><td>1111.2</td><td></td></tr><tr><td>SK-BR-3 [SKBR3] Línea celular</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>SK-OV-3 [SKOV-3; SKOV3] Línea celular</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr><tr><td>Solución de parada 1x</td><td>Abcam</td><td>ab210900</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contador celular automatizado</td><td>Bio-rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>sustrato TMB 1x</td><td>Abcam</td><td>ab210902</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td>Ohaus 30392117</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de movimiento ondulatorio</td><td>Ohaus</td><td>30391968</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo inmunoquímico validado para la determinación completa del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano liberado y unido a las células

Validated Immunochemical Assay for Comprehensive Determination of the Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Released from and Bound to Cells

Validación ELISA sándwich El ensayo recientemente desarrollado requiere un procedimiento de validación. Los parámetros de validación importantes incluyen linealidad, precisión y límites de detección, es decir, límite inferior de detección (LLOD) y límite superior de detección. En el artículo anterior, hemos realizado una validación exhaustiva del método. La linealidad del ELISA se probó utilizando las muestras simuladas para concentraciones bajas (2, 5, 10 ng/mL), medias-altas (30 ng/mL) y significati...

Ensayo inmunoquímico validado para la determinación completa del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano liberado y unido a las células

Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) is a well-established cancer marker. It became a very successful diagnostic and therapeutic target, ...

validated-immunochemical-assay-for-comprehensive-determination-human

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El ensayo de liberación de cromo, un ensayo común para la detección de la actividad de células T citotóxicas, tiene varias limitaciones. El uso de células T CD8 específicas de antígeno y la línea tumoral de cáncer de mama humano, SKBR3, en el presente artículo, un enfoque basado en impedancia se examinó por la capacidad de detección de muerte celular.

La determinación óptima de la actividad citotóxica de las células T específicas Her2Neu CD8 Humanos comparando el Ensayo de liberación de Cr51 al Sistema xCELLigence

Durante los últimos años, los ensayos basados ​​en células vivas se han utilizado con éxito para detectar anticuerpos contra antígenos de superficie y conformacionales. Aquí se describe un método que utiliza el flujo de alto rendimiento citometría permite el análisis de grandes cohortes de pacientes. La detección de nuevos anticuerpos será mejorar el diagnóstico y el tratamiento de trastornos del sistema inmune-mediada.

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

Este protocolo describe el marcaje del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en células de fibroblastos COS7, y la posterior microscopía correlativa de luz y electrónica de células enteras en estado hidratado. La etiqueta contenía puntos cuánticos fluorescentes. El protocolo se puede utilizar para estudiar la estequiometría del EGFR a nivel de molécula individual.

El estudio de la estequiometría de factor de crecimiento epidérmico en células intactas utilizando microscopía correlativa

Se describe un bioensayo sencillo basado en células para la detección, cuantificación y seguimiento de la actividad de los miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular de ligandos. El ensayo utiliza receptores quiméricos expresados ​​en una línea celular dependiente de factor para proporcionar una evaluación semi-cuantitativa o cuantitativa de la unión al receptor y la reticulación por el ligando.

Un ensayo biológico simple para la Evaluación de Factores de Crecimiento Endotelial Vascular

Isoeléctrica capilar es una técnica basada en anticuerpos, ultrasensible, alto rendimiento, permitiendo la caracterización detallada de las proteínas y sus isoformas de muestras biológicas muy pequeñas. A continuación describe un protocolo para la detección y cuantificación de proteínas específicas y sus isoformas de manera automatizada y robotizada.

Detección altamente sensible y cuantitativa de las proteínas y sus isoformas por método capilar isoeléctrica

Anticuerpos que se unen a los receptores de blanco en la superficie celular pueden conferir conformación y alteraciones clustering. Estos cambios dinámicos tienen implicaciones para caracterizar el desarrollo de fármacos en las células diana. Este protocolo utiliza la microscopia confocal y espectroscopia de la correlación de imagen a través de ImageJ/FIJI para cuantificar el grado de agrupamiento en la superficie celular del receptor.

Agregación del Receptor de superficie celular microscopia confocal revela a través espectroscopia de la correlación de imagen

Aquí presentamos un método de citometría de flujo basadas en células para detectar anticuerpos neutralizantes u otros factores que interfieren con la absorción celular de terapias de reemplazo de la enzima en una matriz humana, tales como líquido cefalorraquídeo (LCR) o suero humano.

Detección de anticuerpos que neutralizan la absorción celular de terapias de reemplazo enzimático con un ensayo basado en células

Describimos un sistema de ensayo cuantitativo de citolisis in vitro en tiempo real para evaluar la potencia de las células T del receptor de antígeno quimérico dirigidas a células tumorales líquidas y sólidas. Este protocolo se puede ampliar para evaluar otras células efector inmune, así como tratamientos combinados.

Un ensayo de potencia en tiempo real para células T receptores de antígeno quimérico dirigido a células cancerosas sólidas y hematológicas

Un paso necesario en el desarrollo de aptámeros anticancerosos es probar su unión al objetivo. Demostramos un ensayo basado en citometría de flujo para estudiar esta unión, enfatizando la importancia de incluir un aptámero de control negativo y células cancerosas que sean positivas o negativas para esa proteína en particular.

Un ensayo de unión a proteínas de superficie celular basado en citometría de flujo para evaluar la selectividad y la especificidad de un aptámero anticanceroso

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de citotoxicidad mediada por células (ADCC) dependiente de anticuerpos utilizando un kit de bioensayo ADCC. Este método ofrece una valiosa herramienta para dilucidar el mecanismo ADCC y evaluar el potencial terapéutico de los anticuerpos en la inmunoterapia contra el cáncer.

Evaluación de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos en células cancerosas mediante el bioensayo reportero de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos

Aprende un ensayo ELISA sandwich validado para cuantificar HER2 unido y liberado en células cultivadas y muestras de pacientes. Este método mejora el diagnóstico y monitoreo del cáncer.

Ensayo inmunoquímico validado para la determinación completa del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano liberado y unido a las células (Video) | JoVE Journal

Ensayo inmunoquímico validado para la determinación completa del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano liberado y unido a las células

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