Ensayo inmunoquímico validado para la determinación completa del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano liberado y unido a las células

Presentamos un sándwich validado, ELISA, que utiliza nuevos anticuerpos monoclonales, que permite una cuantificación precisa del dominio extracelular unido y liberado a células de la proteína HER2 para células cultivadas in vitro y muestras de pacientes.

El protocolo aborda la necesidad de un ensayo preciso y validado para correlacionar la concentración de proteína HER2 circulante con las manifestaciones clínicas de la enfermedad en el diagnóstico y la investigación.

El amplio rango de trabajo del ensayo, la variedad de tipos de muestras y la fiabilidad de los resultados podrían abrir nuevas oportunidades para un análisis exhaustivo del estado del receptor en modelos in vitro e in vivo.

El ELISA desarrollado se utilizará para la cuantificación de HER2 liberado por los tejidos cancerosos en diferentes excreciones del cuerpo humano como sangre, fluidos peritoneales o moco.

[Instructor] Para comenzar, separe las células con tripsina después de que alcancen el 80% de confluencia y recójalas en un tubo cónico separado de 15 mililitros. Después de contar las células usando un contador automático de células y sembrar tres veces 10 a la potencia de cinco células por pocillo en una placa de 12 pocillos con un mililitro de medio de crecimiento. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada que contenga un 5% de dióxido de carbono. Del cultivo de 24 horas, recoja el medio de cultivo de un pocillo de cada línea celular en un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar las muestras recogidas a 10.000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo para almacenarlo a menos 20 grados centígrados. Lave las células restantes en cada pocillo con un mililitro de PBS frío, aspire suavemente y deseche el PBS. Luego, agregue 200 microlitros de tampón RIPA, suplementado con un inhibidor de proteasa al 1% a cada pocillo e incube durante cinco minutos. Ahora, raspe las células con un raspador de células y mezcle el lisado pipeteando varias veces para homogeneizar. Recoja las células lisadas en un nuevo tubo y aspire lentamente la muestra en una jeringa de dos mililitros equipada con una aguja de calibre 21 que mide 0,8 por 40 milímetros. Después de aspirar de cinco a 10 veces, centrifugar las muestras recolectadas a 10.000 G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo para almacenarlo a menos 20 grados Celsius. Diluya el anticuerpo capturador Anti-HER2 a un microgramo por mililitro en tampón codificante. Con una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de la solución de anticuerpos de captura a cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos. Cubra la placa con una película de sellado. Incube la placa durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de la incubación durante la noche, coloque la placa a temperatura ambiente en un agitador de microplacas horizontal durante una hora. Con una lavadora de microplacas, aspire la solución de recubrimiento y lave cada pocillo tres veces con 300 microlitros de PBST. A continuación, con una pipeta multicanal, añadir 100 microlitros de tampón de bloqueo que contenga un 5% de leche desnatada en polvo en PBS a cada pocillo recubierto para bloquear los sitios de unión no específicos. Ahora, prepare la curva de calibración y el control positivo. Agregue dos microlitros de un miligramo por mililitro, solución madre de HER2 a 1,998 microlitros de PBS para crear uno estándar de trabajo de 1000 nanogramos por mililitro. Para el estándar dos, agregue 500 microlitros del estándar uno a 500 microlitros de PBS y mezcle bien para lograr una concentración de 50 nanogramos por mililitro. Prepare la dilución en serie para generar estándares del tres al siete. A continuación, prepare muestras de matriz utilizando lisados celulares de PBS y medio de cultivo enriquecido con concentraciones conocidas de HER2. Diluir los lisados celulares uno a 2000 con 2,5 microlitros de lisado y cinco mililitros de PBS para obtener niveles de HER2 por debajo del límite de detección. Para preparar una solución de dos nanogramos por mililitro, agregue ocho microlitros de estándar uno a 392 microlitros de medio de cultivo PBS o lisado celular y mezcle bien. Con una pipeta de un solo canal, agregue 100 microlitros de PBS estándar en blanco y pruebe las muestras cada una por triplicado en sus respectivos pocillos de la placa ELISA recubierta y bloqueada. Después de una hora a 37 grados centígrados en una cámara de humedad, lave la placa con una lavadora de microplacas. Para detectar la unión de anticuerpos, diluya el anticuerpo de detección biotinilado en PBS a una concentración de trabajo de un microgramo por mililitro. Luego, usando una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de esta solución de anticuerpos detectantes a cada pocillo. A continuación, diluya el AVID y el HRP conjugados de uno a 40,000 en 40 mililitros de PBST. Con una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros del conjugado diluido a cada pocillo. Después de incubar y lavar la placa, use una pipeta multicanal para agregar 100 microlitros de sustrato de 3,3 5,5 tetrametilbencidina a cada pocillo para iniciar la reacción métrica de color. Luego, cubra la placa con una película de sellado. Incube la placa a 37 grados centígrados durante uno a cinco minutos, protegiéndola de la luz mientras monitorea el desarrollo del color. Cuando se alcance la intensidad de color deseada, agregue 100 microlitros de solución de parada a cada pocillo para terminar la reacción. Finalmente, mida la absorbancia a 450 nanómetros usando un lector de microplacas. Utilizando una curva de calibración de cuatro parámetros, calcule la concentración de la muestra en función de la ecuación de la curva. El sándwich desarrollado, ELISA, demostró un rango de trabajo para la proteína HER2 de 1,56 a 100 nanogramos por mililitro con un coeficiente de determinación de uno que indica una excelente coincidencia. La concentración de HER2 en el medio de cultivo aumentó con el tiempo para todas las líneas celulares probadas con los valores más altos a las 72 horas. Las células SK-OV-3 y SK-BR-3 mostraron concentraciones de HER2 aproximadamente diez y 50 veces más altas, respectivamente, en comparación con las células MDA-MB-231 en el medio de cultivo a las 24 horas. Del mismo modo, los niveles de HER2 en los lisados fueron aproximadamente tres y cinco veces más altos para SK-OV-3 y SK-BR-3, respectivamente. Curiosamente, el medio de cultivo celular contenía concentraciones 1000 veces más bajas del antígeno probado en comparación con la proteína unida a la membrana que se encuentra en los lisados de células completas.