Name: Modificación enzimática y evaluación por citometría de flujo de proteínas mostradas en la superficie de la levadura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Aprende a evaluar modificaciones enzimáticas en levadura mediante visualización de sustratos en superficie celular y análisis por citometría de flujo. Este protocolo permite mapear cinéticas de desfosforilación con SHP-2.

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1. Crecimiento celular de levaduras que albergan plásmidos e inducción de la expresión de proteínas
<ol>
	<li>Siguiendo la receta descrita en la Tabla 1, prepare los medios necesarios para el crecimiento de levaduras que no contienen plásmidos (YPD), el crecimiento de células de levadura que contienen plásmidos (SD-CAA) y la inducción de la expresión de proteínas (SRG-CAA), así como placas SD-CAA.</li>
	<li>El ADN plásmido de la muestra de levadura que contiene el par quinasa-sustrato en células de levadura EBY-100 a través del método basado en cationes de litio30,31, comúnmente adoptado para su uso en kits de transformación de levadura de una variedad de fabricantes. NOTA: La electroporación32 u otras técnicas preferidas de transformación de plásmidos de levadura se pueden utilizar dependiendo de la construcción de plásmido que se esté transformando.</li>
	<li>Prepare un tubo de cultivo de 14 mL con 10 mL de medio YPD. Inocular células EBY-100 y cultivarlas en una incubadora agitadora a 30 °C, 300 rpm hasta que el cultivo alcance una densidad óptica (OD600nm) de 0,8-1,0 (8 x 106- 1 x 107 células/mL). NOTA: El diámetro exterior de600 nm se mide preparando cubetas de muestra de 3 ml que contienen diluciones 1:10 de cultivos de levadura en sus respectivos medios y cubetas en blanco de 3 ml que contienen los medios utilizados para las diluciones de muestras. El programa OD600nm en el espectrofotómetro se utiliza para medir primero la cubeta en blanco, luego cada cubeta de muestra configurando la dilución correspondiente preparada para cada muestra. 1 OD600 nm corresponde a 1 × 107 levaduras/mL.</li>
	<li>Recolectar las células centrifugando el cultivo a 1.000 x g durante 3 min, y lavar con la1ª solución de lavado suministrada en el kit de transformación de levaduras, o TE (10 mM de Tris-HCl y 1,0 mM de EDTA)31.</li>
	<li>Vuelva a granular las células a 1.000 x g durante 3 min y vuelva a suspender en 1 mL del tampón de transformación proporcionado en el kit de transformación de levadura, o agua estéril. Las pilas deben alícuotas de 50 μL y pueden almacenarse a -80 °C durante un máximo de 6 meses.</li>
	<li>Para la transformación de plásmidos, se prepara una alícuota por plásmido y se descongela en hielo, luego, se agregan directamente a las células 0,5-1,5 μg de ADN plásmido que contiene la construcción de visualización de levadura. Se añaden 0,5 mL de la solución de transformación proporcionada en el kit de transformación de levadura, o 0,5 mL de una solución estéril de polietilenglicol al 50% y LiOAc0,1 M 31. Combine bien la mezcla de células, ADN plasmídico y solución de transformación mediante pipeteo.</li>
	<li>Incubar la mezcla de transformación estáticamente durante 30-60 min a 30 °C, la mezcla de vórtice a intervalos de 15 min. Recolectar las células centrifugando a 1.000 × g durante 3 min.</li>
	<li>Prepare un tubo de cultivo de 14 mL con 4,5 mL de medio SD-CAA. Vuelva a suspender las células que contienen el plásmido deseado en 500 μL de SD-CAA e inocule los 4,5 mL preparados.</li>
	<li>Teniendo cuidado de no perforar el agar, distribuya 50 μL de los 5 mL de cultivo inoculado en una placa SD-CAA e incube estáticamente a 30 °C durante 48 h para determinar la eficiencia de la transformación.</li>
	<li>Incubar los 5 mL de cultivo celular SD-CAA en una incubadora agitadora a 30 °C, 300 rpm durante al menos 18 h. Supervise la densidad óptica (OD600 nm) después de 16 h y 20 h. Una vez que la muestra haya crecido hasta una densidad óptica suficiente que no exceda de 6, centrifugar el cultivo durante 3 min a 2.500 × g. Deseche el sobrenadante sin alterar la pelletza de levadura.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet de levadura en SRG-CAA a un diámetro exterior final de600 nm inferior a 1 (&lt;1 × 107 levaduras/ml).</li>
	<li>Incubar el cultivo de levadura en una incubadora agitadora a 30 °C, 300 rpm durante al menos 8 h pero no más de 24 h. NOTA: La inducción de la expresión de proteínas en las células de levadura puede variar entre 20 y 37 °C. 30 °C es adecuado para la síntesis de pares quinasa/sustrato29,33, pero puede ajustarse si se considera necesario para las proteínas específicas que se están estudiando.</li>
	<li>Mida OD600 nm para determinar la densidad de celdas. NOTA: El protocolo puede detenerse en este punto almacenando los cultivos de levadura a 4 °C.</li>
</ol>
2. Biotinilación del anticuerpo antifosfotirosina 4G10
<ol>
	<li>Vuelva a suspender un vial de 2 mg de PEG4-NHS-Biotina hasta una concentración final de 5 mM añadiendo 680 μL de PBS estéril. NOTA: La resuspensión de PEG4-NHS-Biotina debe realizarse inmediatamente antes de que se lleve a cabo la reacción de biotinilación. NHS se hidroliza en solución acuosa. El uso de PBS y viales estériles es importante para la preparación de reactivos para el almacenamiento a largo plazo y para su uso en ensayos basados en células para mitigar cualquier efecto potencial de los contaminantes en la viabilidad de los reactivos o en los ensayos sensibles que se están realizando.</li>
	<li>En función de la concentración de anticuerpos 4G10, agregue 100 μg de anticuerpo en un vial estéril de 1,7 ml.</li>
	<li>Añada 1 μL de los 5 mM de PEG4-NHS-Biotina preparados del paso 2.1 al vial que contiene los 100 μg de anticuerpo 4G10 para lograr una proporción molar de biotina a anticuerpo de 7,5:1. Pipetear la mezcla suavemente para homogeneizar la reacción.</li>
	<li>Incubar la reacción a temperatura ambiente con rotación constante durante al menos 2 h.</li>
	<li>Siga el protocolo del fabricante para las columnas de desalinización de centrifugación de 0,5 mL para intercambiar el tampón del 4G10 biotinilado (B-4G10) en PBS. NOTA: Las columnas de desalinización con un corte de peso molecular (MWCO) de 7 kDa se usan comúnmente para la biotinilación de anticuerpos para permitir que la biotina y otras moléculas pequeñas sin reaccionar se eliminen mientras se retiene el anticuerpo más grande.</li>
	<li>Diluir el anticuerpo B-4G10 hasta una concentración final de 1 μM en PBSA (PBS con 1 g/L de albúmina sérica bovina). Alícuota el anticuerpo B-4G10 en volúmenes más pequeños para evitar ciclos repetidos de congelación/descongelación. NOTA: Los anticuerpos biotinilados pueden almacenarse a 4 °C para su uso diario durante un máximo de 3 meses sin perder una eficacia significativa. Almacene el resto de las alícuotas que no estén en uso a -20 °C durante un máximo de 2 años.</li>
</ol>
3. Desfosforilación de sustratos expresados en la superficie celular de la levadura
<ol>
	<li>Prepare la solución tampón de trabajo 2x como se describió anteriormente en la literatura34. NOTA: Se recomienda 2x para facilitar la medición de los ingredientes necesarios.</li>
	<li>Prepare el tampón de trabajo para las muestras en un vial de 1,7 ml diluyendo la solución tampón 2x preparada en el paso 3.1 1:2 en agua desionizada. NOTA: El volumen total de reacción para cada muestra será de 20 μL, y cada muestra requerirá entre 10 μL y 18 μL de tampón de trabajo. Prepare suficiente tampón de trabajo para todas las muestras o controles.</li>
	<li>Siguiendo la preparación de muestra recomendada descrita en la Tabla 2, etiquete los viales de 1,7 ml con el nombre de control o muestra correspondiente.</li>
	<li>Sobre la base del diámetro exterior de600 nm medido en el paso 1.9, calcule el volumen de cultivo necesario para recuperar dos millones (2 × 106) células de levadura del cultivo de levadura correspondiente para cada muestra.</li>
	<li>Añada el volumen de cultivo de levadura calculado en el paso anterior en el vial de 1,7 ml para cada muestra.</li>
	<li>Centrifugar el vial durante 1 min a 4.500 × g. Retire con cuidado el sobrenadante con una micropipeta y deséchelo como residuo biopeligroso.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células peletizadas en 1 ml de PBSA y repita el paso 3.6. NOTA: Es importante eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante sin alterar las células granuladas.</li>
	<li>Sobre la base de su concentración de existencias, calcule el volumen de SHP-2 humano recombinante necesario para tener una concentración final de 1.000 nM en un volumen total de reacción de 20 μL. NOTA: La SHP-2 recombinante debe alícuota en pequeños volúmenes para que cualquier proteína utilizada en cada ensayo no haya pasado por más de dos ciclos de congelación-descongelación. Cualquier SHP-2 que quede de una alícuota después de que todas las muestras se hayan preparado para un ensayo debe desecharse. Las concentraciones de enzimas recombinantes pueden variar en función del número de lote. El SHP-2 recombinante se formula comúnmente a una concentración de 0,2-0,4 mg/mL. Para una concentración de stock de 0,324 mg/mL SHP-2, esto corresponde a una concentración de stock de 4,696 μM (SHP-2 tiene un peso molecular de 69 kDa). 4,26 μL de la cepa SHP-2 en una reacción de 20 μL dan como resultado una concentración de reacción final de 1.000 nM SHP-2.</li>
	<li>Añadir 7,7 mg de DTT en 10 mL de agua desionizada preparada en un cónico de 15 mL para crear una solución de DTT de 5 mM. Si las limitaciones del equipo dificultan el peso de miligramos, agregue 0,77 g de DTT a 10 mL de agua desionizada, luego realice una dilución de 100x para crear la solución de DTT de 5 mM utilizada para el ensayo. NOTA: La solución de TDT se puede preparar en soluciones madre de mayor concentración para diluir a 5 mM si no es posible medir cantidades a escala de miligramos utilizando el equipo disponible. La solución de DTT debe prepararse fresca antes de la resuspensión celular en un tampón de trabajo debido a su tendencia a hidrolizarse, lo que la hace inestable durante largos períodos cuando se diluye en agua.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células peletizadas en el tampón de trabajo preparado en el paso 3.2 de modo que el volumen final de reacción en cada muestra o control sea de 20 μl. NOTA: La cantidad de tampón de trabajo añadido debe calcularse en función de la cantidad de DTT (2 μL) y SHP-2 (calculada en el paso 3.8) que habrá en cada muestra.</li>
	<li>Añada 2 μL de la solución de DTT de 5 mM preparada en el paso 3.9 a cada muestra o control para obtener una concentración de reacción final de 0,5 mM de DTT.</li>
	<li>Añada el volumen de SHP-2 calculado en el paso 3.8 a cada muestra hasta obtener un volumen final de 20 μL y mezcle suavemente con una micropipeta.</li>
	<li>Envuelva las tapas de los viales de muestra en parafilm para evitar fugas o contaminación cruzada.</li>
	<li>Incubar las muestras a 37 °C durante 2 h en un rotor a velocidad constante.</li>
	<li>Retire las muestras del rotor y detenga la reacción agregando 1 mL de PBSA a cada muestra.</li>
	<li>Repita el paso 3.6.</li>
</ol>
4. Marcaje celular y análisis por citometría de flujo de sustratos desfosforilados
<ol>
	<li>Vuelva a suspender las muestras del paso 3.16 en una mezcla de 20 μL de sus reactivos primarios correspondientes, como se describe en la Tabla 2. Incubar las muestras durante 20 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Se ha calculado que todas las concentraciones de reactivos utilizadas son superiores al número de proteínas expresadas en la superficie de las células de levadura. El cálculo supone la expresión de 10.000 proteínas/célula de todas las levaduras 2 x 106 en una muestrade 35, cuando habitualmente solo ~50% de ellas lo hacen. La Tabla 3 muestra la proporción de reactivos de marcado en exceso para cada uno de los reactivos expresada en la Tabla 2, calculada de la siguiente manera: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68208/68208eq1v3.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Centrifugar las muestras a 4.500 × g durante 1 min y desechar el sobrenadante como residuo biopeligroso.</li>
	<li>Lave las células una vez resuspendiéndolas en 1 mL de PBSA. Repita el paso 4.2.</li>
	<li>Vuelva a suspender las muestras en una mezcla de 20 μL de sus reactivos secundarios correspondientes, como se describe en la Tabla 2. Incubar las muestras durante 15 min en ausencia de luz.</li>
	<li>Repita el paso 4.2.</li>
	<li>Repita el paso 4.3.</li>
	<li>Vuelva a suspender las muestras lavadas en 300-500 μL de PBSA y transfiéralas a tubos de poliestireno de 5 mL para analizarlas inmediatamente utilizando un citómetro de flujo adecuado. NOTA: Si es necesario transportar muestras, manténgalas sobre hielo húmedo. No se recomienda, pero las muestras se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 h como gránulos húmedos.</li>
	<li>Después de realizar el inicio y la preparación necesarios del citómetro para un nuevo experimento, haga clic en el botón Nuevo experimento dentro del menú Archivo , asigne un nombre al experimento y haga clic en Guardar para asegurarse de que los datos adquiridos se guarden en la ruta de archivo deseada.</li>
	<li>Seleccione el icono de diagrama de puntos dentro de la barra de herramientas superior para crear dos o más diagramas de puntos para cada muestra que se va a ejecutar. Para uno de los diagramas de puntos, seleccione el nombre del eje X para mostrar el canal FSC-A y el nombre del eje Y para mostrar el canal SSC-A. Este gráfico muestra la dispersión lateral - área frente a la dispersión directa - área y se utiliza para controlar las células de levadura para su posterior análisis.</li>
	<li>En otro diagrama de puntos, seleccione el nombre del eje X para mostrar el canal en el que el reactivo secundario dirigido al anticuerpo primario de la etiqueta antiepítopo emite fluorescencia. Seleccione el nombre del eje Y para mostrar el canal en el que el reactivo secundario de estreptavidina emite fluorescencia. Este gráfico mostrará solo los eventos cerrados desde el diagrama de dispersión lateral frente al frontal como células de levadura y se utiliza para mostrar la fosforilación de tirosina en el eje Y y la expresión de la superficie del sustrato en el eje X. NOTA: En este ejemplo, el reactivo secundario dirigido al anticuerpo primario anti-epítopo marca fluorescencia en el canal FITC (AF-488) y el reactivo secundario de estreptavidina emite fluorescencia en el canal AF-647. Los canales utilizados pueden variar en función de los reactivos primarios y secundarios utilizados durante el etiquetado.</li>
	<li>Coloque cada tubo de muestra en el soporte del tubo del citómetro y seleccione Ejecutar para que el citómetro comience a cargar la muestra y adquirir datos. Ajuste los eventos que se van a mostrar, los eventos que se van a registrar, el tiempo que se va a registrar y el caudal de muestra según sea necesario.</li>
	<li>Defina una puerta que rodee las células de levadura sanas en la gráfica SSC-A frente a FSC-A creada en el paso 4.9. La figura 1 ilustra una representación descriptiva de la estrategia de compuerta que se va a aplicar. NOTA: En el gráfico SSC-A frente a FSC-A, 100.000 eventos para mostrar y 50.000 eventos para registrar dentro de la puerta de levadura definida es una buena guía para visualizar y recopilar datos suficientes para un análisis posterior. Se pueden aplicar estrategias de compuerta más estrictas para seleccionar la levadura singlete en función de un gráfico de altura de dispersión directa frente a área de dispersión directa, como se informó recientemente36. La estrategia de compuerta que se muestra en la Figura 1 corresponde a un enfoque menos estricto, que incluye levadura singlete y algo de levadura doblete a través de la compuerta de dispersión.</li>
	<li>Registre la fluorescencia de todas las muestras de control utilizando un analizador de citometría de flujo. Las muestras de control se recogen primero de forma rutinaria para ayudar a definir una estrategia de compuertas, como se describe a continuación en el paso 4.14.</li>
	<li>Defina una estrategia de compuerta para su parcela creada en el paso 4.10 antes de analizar las muestras tratadas. La figura 1 ilustra una representación descriptiva de la estrategia de compuerta que se va a aplicar.</li>
	<li>Registre la fluorescencia de las muestras desfosforiladas utilizando el citómetro de flujo y la estrategia de compuerta definida en los pasos 4.12 y 4.14.</li>
	<li>Analice los datos de citometría de flujo adquiridos mediante un software de análisis de citometría de flujo.</li>
	<li>Evalúe la desfosforilación midiendo y comparando la mediana del eje Y de las células que expresan proteínas en su superficie y la fosforilación de referencia proporcionada por las células que no se muestran entre las muestras y los controles. Calcule la diferencia porcentual de fosforilación mediana de la siguiente manera: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68208/68208eq2v5.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>

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<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+TEV+protease+variants+by+yeast+ER+sequestration+screening+%28YESS%29+of+combinatorial+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (18), 7229-7234 (2013).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+endoplasmic+reticulum+sequestration+screening+for+the+engineering+of+proteases+from+libraries+expressed+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast endoplasmic reticulum sequestration screening for the engineering of proteases from libraries expressed in yeast.</a> Methods Mol Biol. 1319, 81-93 (2015).</li>
<li>Semenza, J. C., Hardwick, K. G., Dean, N., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERD2%2C+a+yeast+gene+required+for+the+receptor-mediated+retrieval+of+luminal+ER+proteins+from+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ERD2, a yeast gene required for the receptor-mediated retrieval of luminal ER proteins from the secretory pathway.</a> Cell. 61 (7), 1349-1357 (1990).</li>
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<li>Margittai, É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+H2O2+in+the+endoplasmic+reticulum+promotes+in+vivo+disulfide+bond+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Production of H2O2 in the endoplasmic reticulum promotes in vivo disulfide bond formation.</a> Antioxid Redox Signal. 16 (10), 1088-1099 (2012).</li>
<li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol Rev. 57 (2), 383-401 (1993).</li>
<li>Ezagui, J., Stern, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+screening+on+the+yeast+surface+by+magnetic+bead+selection+and+FACS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation screening on the yeast surface by magnetic bead selection and FACS.</a> Methods Mol Biol. 2681, 275-290 (2023).</li>
<li>Yarnall, M. T. N., Kim, S. H., Korntner, S., Bishop, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+SHP2+and+SHP1+protein+tyrosine+phosphatase+domains+by+a+non-conserved+%E2%80%9Cbackdoor%E2%80%9D+cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the SHP2 and SHP1 protein tyrosine phosphatase domains by a non-conserved “backdoor” cysteine.</a> Biochem Biophys Rep. 32, 101370(2022).</li>
<li>Dustin, C. M., Heppner, D. E., Lin, M. J., van der Vliet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+tyrosine+kinase+signalling%3A+more+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of tyrosine kinase signalling: more than meets the eye.</a> J Biochem. 167 (2), 151-163 (2020).</li>
<li>Stern, L. A., Csizmar, C. M., Woldring, D. R., Wagner, C. R., Hackel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titratable+avidity+reduction+enhances+affinity+discrimination+in+mammalian+cellular+selections+of+yeast-displayed+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">Titratable avidity reduction enhances affinity discrimination in mammalian cellular selections of yeast-displayed ligands.</a> ACS Comb Sci. 19 (5), 315-323 (2017).</li>
<li>Waldman, A. C., Rao, B. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+residue+specificities+of+epigenome+enzymes+by+yeast+surface+display%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping the residue specificities of epigenome enzymes by yeast surface display.</a> Cell Chem Biol. 28 (12), 1772-1779.e4 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Botellas de medios de 1 l&nbsp;</td><td>Corning</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1.7/2.0 mL Microtubos</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L Puntas de pipeta SureOne</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-438</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Puntas de pipeta SureOne</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-408</td><td></td></tr><tr><td>12 mL Tubos de poliestireno de fondo redondo</td><td>Greiner</td><td>07-000-212</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de 3 mL de platic</td><td>MARCA</td><td>759076D</td><td></td></tr><tr><td>300 &micro; L Puntas de pipeta SureOne</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-411</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipetas serológicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Caseína ácida (Casaminoácidos)</td><td>Balanza analítica Fisher Scientific</td><td>BP-1424-500</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td> Placa de Petri bacteriológica 30243397 <td></td><td>Mettler</td></tr><tr><td>Toledo&nbsp;</td><td>Corning</td><td>Falcon 351008</td><td></td></tr><tr><td>Cabinas de bioseguridad</td><td>Labconco</td><td>Logic Clase II, Tipo A2&nbsp;</td> Bioespectrómetro 302310102 <td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Kinetic 6136000010</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Fisher biorreactivos</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Citometría de flujo Analizador&nbsp;</td><td>Beckam Coulter</td><td>Cytoflex C09745</td><td>Software CytExpert</td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Fisher biorreactivos</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Burro anticabra FITC</td><td>Invitrogen</td><td>A16000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>H56165.30</td><td></td></tr><tr><td>Ez-Link PEG4-NHS-Biotina</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39259</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transformación de levadura Frozen-EZ II</td><td>Zymo Research</td><td>T2001</td><td></td></tr><tr><td>Galactosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador de Propósito General</td><td>Marvel Scientific</td><td>MS24RAS4RW</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-myc tag anticuerpo&nbsp;</td><td>Centrífuga de Mictrotubo Bethyl</td><td>A190-104A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5425 R 5406000313</td><td></td></tr><tr><td>Mini Incubadora Refrigerada de Baja Temperatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2632</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo antifosfotirosina de ratón 4G10</td><td>BioXcell</td><td>BE0194</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>M PM999</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Controlador de pipetas</td><td>Fisher bioreagents BP399-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>easypet 3 4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Raffinosa</td><td>Thermo Scientific</td><td>J21060-36</td><td></td></tr><tr><td>Proteína SHP-2 humana recombinante activa</td><td>R& Centrífuga</td> refrigerada <td>D Systems 1894-SH</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae levadura muestra la superficie de la cepa EBY 100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitadores</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0002 New Brunswick Innova 42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Juego de pipetas de un solo canal&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-151</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio dihidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico heptahidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico monohidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>Balanza de carga superior</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>EMD Millipore</td><td>648317-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de rotación de revólver</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-341</td><td></td></tr><tr><td>Papel de pesaje&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr><tr><td>Base de nitrógeno de levadura</td><td>BD Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Columnas de desalinización&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>89883</td><td></td></tr></tbody></table>

modificación enzimática y evaluación por citometría de flujo de proteínas mostradas en la superficie de la levadura

Enzymatic Modification and Flow Cytometry Assessment of Yeast Surface Displayed Proteins

El análisis de citometría de flujo a partir de una réplica individual de nuestro sistema modelo incubado durante 2 h sin (Figura 1A) y con (Figura 1B) 1.000 nM SHP-2 revela una diferencia de fosforilación mediana del 63,6%, que se define como la relación entre la mediana del eje Y (fosforilación) de todos los eventos mostrados en la superficie menos la señal de fosforilación de referencia definida como la mediana del eje Y de los eventos no mostrados entre la mu...

Modificación enzimática y evaluación por citometría de flujo de proteínas mostradas en la superficie de la levadura

Yeast surface display is a genotype-phenotype linkage strategy that empowers high-throughput screening of protein function. Traditionally, yeast surface ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un enfoque sólido para controlar la entrega de los orgánulos de la luz del ácido de la vacuola de levadura para la degradación y el reciclaje se describe. El método se basa en el etiquetado específico de los orgánulos de destino con una codificada genéticamente doble emisión de fluorescencia de pH biosensor, y la visualización de las células individuales mediante microscopía de fluorescencia.

Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Dos métodos complementarios basados ​​en citometría de flujo y microscopía se presentan que permiten la cuantificación, a nivel de una sola célula, de la dinámica de la expresión génica inducidos por la activación de una vía MAPK en la levadura.

La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

Este artículo describe un ensayo basado en el crecimiento de levaduras para la determinación de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas. También demuestra un método para la extracción rápida de proteínas de levadura, adecuado para la transferencia de Western para confirmar bioquímicamente los requisitos de degradación. Estas técnicas se pueden adaptar para monitorear la degradación de una variedad de proteínas.

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

La cuantificación precisa de los eventos de tráfico vesicular a menudo proporciona información clave sobre las funciones de proteínas específicas y los efectos de las mutaciones. En este artículo se presentan métodos para utilizar la pHluorina supereclíptica, una variante de GFP sensible al pH, como herramienta para la cuantificación de eventos endocíticos en células vivas mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa y citometría de flujo.

Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

Este artículo describe un protocolo de citometría de flujo basado en FRET para cuantificar el autoensamblaje de proteínas en células De. cerevisiae y HEK293T.

Detección y caracterización de autoensamblaje de proteínas en Vivo por citometría de flujo

La levadura de fisión se utiliza aquí como huésped heterólogo para expresar proteínas citoesqueléticas bacterianas como FtsZ y MreB como proteínas de fusión traduccional con GFP para visualizar su polimerización. Además, los compuestos que afectan a la polimerización se identifican mediante imágenes con un microscopio de fluorescencia.

La levadura de fisión como plataforma para el cribado de fármacos antibacterianos dirigidos a las proteínas del citoesqueleto bacteriano

Este protocolo describe los pasos esenciales para llevar a cabo campañas de selección de exhibición de superficie de levadura para enriquecer las variantes de proteínas que se unen a un antígeno de interés.

Ingeniería de proteínas por visualización de superficie de levadura

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar la supervivencia post-estrés en muestras de levadura. El ensayo emplea dos colorantes fluorescentes, SYTO 9 y yoduro de propidio (PI), para cuantificar la integridad de la membrana plasmática. Utiliza la citometría de flujo para proporcionar estimaciones cuantitativas y reproducibles de las fracciones de células vivas, muertas y dañadas para muestras de estrés postoxidativo.

Un ensayo VIVO/MUERTO optimizado junto con citometría de flujo para cuantificar la supervivencia post-estrés en células de levadura

En este artículo se describe un método que utiliza multi-espectral citometría de flujo de imágenes para cuantificar la internalización de nanopartículas polianhídrido o bacterias de las células RAW 264.7.

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Aprende a evaluar modificaciones enzimáticas en levadura mediante visualización de sustratos en superficie celular y análisis por citometría de flujo. Este protocolo permite mapear cinéticas de desfosforilación con SHP-2.

Modificación enzimática y evaluación por citometría de flujo de proteínas mostradas en la superficie de la levadura

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