Modificación enzimática y evaluación por citometría de flujo de proteínas mostradas en la superficie de la levadura

Esta investigación se centra en estudiar las modificaciones químicas de las proteínas que dictan cómo se comportan las células. En este caso, el objetivo es comprender las preferencias y la cinética de las enzimas que modifican una variedad de sustratos.

Se ha demostrado por primera vez la capacidad de desfosforilar una molécula de sustrato que se muestra en la superficie de la levadura. Este hallazgo abre posibilidades para el mapeo cinético generalizable de modificaciones enzimáticas que antes no eran accesibles. Esta investigación aborda los desafíos asociados con la comprensión de las interacciones enzimáticas sustrato. Por lo general, se requieren lisados celulares o péptidos personalizados para este tipo de evaluación. Aquí, se proporciona una alternativa a FasL mediante el uso de sustratos con levadura.

Este protocolo avanza la visualización tradicional de la superficie de la levadura hacia el análisis de lo que normalmente serían reacciones enzimáticas intracelulares en el espacio extracelular, lo que permite el análisis FasL de estas interacciones normalmente difíciles de evaluar.

Este protocolo permite la capacidad de interrogar las preferencias de sustrato de una variedad de enzimas a través de métodos de alto rendimiento y realizar estudios cinéticos con una simple lectura.

[Instructor] Para comenzar, descongele una alícuota de las células de levadura preparadas en hielo. Agregue de 0,5 a 1,5 microgramos de ADN plasmídico que contenga la construcción de visualización de levadura directamente a las células. Luego agregue 0,5 mililitros de la solución de transformación o una solución estéril de polietilenglicol al 50% y acetato de litio 0,1 molar. Combine bien la mezcla de células, ADN plasmídico y solución de transformación mediante pipeteo. Incube la mezcla de transformación estáticamente durante 30 a 60 minutos a 30 grados Celsius y agite la mezcla a intervalos de 15 minutos. Cosecha las células centrifugando a 1000G. Prepare un tubo de cultivo de 14 mililitros con 4,5 mililitros de crecimiento de células de levadura que contienen plásmidos, o medios SDCAA. Vuelva a suspender las células que contienen el plásmido deseado en 500 microlitros de SDCAA e inocular los 4,5 mililitros de medio preparados. Distribuya 50 microlitros de los cinco mililitros de cultivo inoculado en una placa SDCAA con cuidado sin perforar la barrena. Incube estáticamente a 30 grados Celsius durante 48 horas para determinar la eficiencia de transformación. Ahora, incube los cinco mililitros de cultivo celular SDCAA en una incubadora agitadora a 30 grados Celsius y 300 RPM durante al menos 18 horas. Monitoree la densidad óptica a 600 nanómetros después de 16 horas y repita nuevamente después de 20 horas. Una vez que la muestra alcance una densidad óptica no superior a seis, centrifugar el cultivo durante tres minutos a 2500 G y desechar el sobrenadante sin alterar el gránulo de levadura. Vuelva a suspender el gránulo de levadura en la inducción de la expresión de proteínas, o medios SRGCAA, a una densidad óptica final a 600 nanómetros menos de uno. Incube el cultivo de levadura en una incubadora agitadora a 30 grados Celsius y 300 RPM durante al menos ocho horas, pero no más de 24 horas. Luego mida la densidad óptica a 600 nanómetros para determinar la densidad celular. Prepare el tampón de trabajo para las muestras diluyendo la solución tampón de trabajo 2X en una proporción de uno a dos con agua desionizada en un vial de 1,7 mililitros. Agregue el volumen apropiado de cultivo de levadura requerido para recuperar dos millones de células de levadura en el vial de 1,7 mililitros para cada muestra. Centrifugar el vial durante un minuto a 4500G y, con una micropipeta, retirar y desechar con cuidado el sobrenadante como residuo biopeligroso. Vuelva a suspender las células granuladas en un mililitro de PBSA antes de repetir la centrifugación y la eliminación del sobrenadante. Déjalo a un lado. Prepare la solución humana recombinante de SHP-2 a una concentración final de 1.000 nanomoles en un volumen total de reacción de 20 microlitros. A continuación, agregue 7,7 miligramos de DTT en 10 mililitros de agua desionizada en un tubo cónico de 15 mililitros para crear una solución de DTT de cinco milimolares. Ahora, tome las células granuladas y vuelva a suspenderlas en el tampón de trabajo para que el volumen de reacción final sea de 20 microlitros por muestra. Agregue dos microlitros de la solución de DTT de cinco milimolares a cada muestra para obtener una concentración final de DTT de 0,5 milimolares. Agregue el volumen preparado de SHP-2 a cada muestra para lograr un volumen final de 20 microlitros y mezcle suavemente con una micropipeta. Envuelva las tapas de los viales de muestra con Parafilm para evitar fugas o contaminación cruzada. Incube las muestras a 37 grados centígrados durante dos horas en un rotor a una velocidad constante. Después de retirar las muestras del rotor, detenga la reacción agregando un mililitro de PBSA a cada muestra antes de centrifugarlas nuevamente durante un minuto. Luego deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las muestras granuladas en una mezcla de 20 microlitros de sus correspondientes reactivos primarios e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de 20 minutos, centrifugar muestras a 4500G durante un minuto y desechar el sobrenadante como residuo biopeligroso. Lave las células una vez volviéndolas a suspender en un mililitro de PBSA antes de centrifugar las células nuevamente. Ahora, vuelva a suspender las muestras en una mezcla de 20 microlitros de sus correspondientes reactivos secundarios e incube durante 15 minutos en la oscuridad. Después de centrifugar las muestras y desechar el sobrenadante, lave las células una vez más con PBSA antes de centrifugarlas nuevamente. A continuación, vuelva a suspender las muestras lavadas en 300 a 500 microlitros de PBSA y transfiéralas a tubos de poliestireno de cinco mililitros para el análisis de citometría de flujo. Después de preparar el citómetro, haga clic en Archivo, seguido del botón Nuevo experimento, asigne un nombre al experimento y haga clic en Guardar para asegurarse de que los datos adquiridos se guarden en la ruta de archivo deseada. Seleccione el icono de diagrama de puntos en la barra de herramientas superior para crear dos o más diagramas de puntos para cada muestra. Para uno de los diagramas de puntos, asegúrese de que el nombre del eje x muestre el canal FSCA y el nombre del eje y muestre el canal SSCA. Para otro gráfico, seleccione el nombre del eje x para mostrar el canal en el que el reactivo secundario dirigido al anticuerpo primario de la etiqueta antiepítopo emite fluorescencia, y el nombre del eje y para mostrar el canal en el que el reactivo secundario de estreptavidina emite fluorescencia. Proporcione un nombre descriptivo para la muestra haciendo clic con el botón derecho en la sonda, seleccionando Editar nombre e ingresando el nombre de la muestra. Coloque cada tubo de muestra en el soporte del citómetro y haga clic en Ejecutar para comenzar a cargar la muestra y adquirir datos. Ajuste los eventos, el tiempo y el caudal según sea necesario. Defina una puerta que rodee las células de levadura sanas en el gráfico SSCA versus FSCA. Luego registre la fluorescencia de todas las muestras de control. Defina una estrategia de compuerta para la parcela creada antes de analizar las muestras tratadas. Registre la fluorescencia de las muestras desfosforiladas utilizando el citómetro y la estrategia de compuerta antes de analizar los datos utilizando el software de citometría de flujo. Evalúe la fosforilación midiendo y comparando la mediana del eje y de las células que expresan proteínas en su superficie, y la fosforilación de referencia proporcionada por las células no reproductoras entre muestras y controles. Finalmente, calcule la diferencia porcentual de fosforilación mediana utilizando la fórmula proporcionada. En esta figura se ilustra el efecto de las concentraciones variables de fosfatasa SHP-2 y los tiempos de incubación sobre la diferencia media de fosforilación en los sustratos mostrados en la superficie de la levadura. La diferencia porcentual de fosforilación mediana disminuyó con el tiempo en todas las concentraciones de SHP-2, con la desfosforilación más alta observada a una concentración de SHP-2 de 1.000 nanomolares a las cuatro horas. Después de dos horas de incubación, 1.000 SHP-2 nanomolares dieron como resultado una diferencia de fosforilación media de aproximadamente el 48,8%, significativamente más baja que la condición de 750 nanomolares en el mismo momento. No se observó una diferencia significativa en la diferencia mediana de fosforilación cuando la incubación se extendió de dos horas a tres horas en concentraciones SHP-2 de 500 nanomolares, 750 nanomolares y 1.000 nanomolares.