Preparación de tejido intacto para el análisis microscópico de la capa de células endospermas en semillas de Arabidopsis en desarrollo y maduras

Uno de nuestros ámbitos de investigación es la ciencia de las semillas. Nuestro objetivo es responder a la pregunta de cómo contribuye el endospermo a la germinación de las semillas. Un ensayo in vitro llamado ensayo de inhibición del crecimiento de semillas ha revelado la importancia fisiológica del endospermo en la germinación de semillas. Las semillas de Arabidopsis son bastante pequeñas y la ubicación de la capa celular del endospermo está debajo de la testa, que son las células. Es un desafío preparar muestras de endospermo sin fijar químicamente. Los análisis anteriores del análisis del endospermo han utilizado muestras fijadas químicamente, por lo que no pudieron observar el movimiento de las proteínas del organismo. Nuestro protocolo permite obtener imágenes de cinco células de la dinámica de las células del endospermo. Nuestro protocolo se puede realizar utilizando equipos de laboratorio estándar y permite una visión más profunda de los mecanismos de eventos y moléculas intercelulares y la función regular del endospermo.

[Narrador] Para comenzar, cultive plantas de Arabidopsis en tierra o lana de roca hasta la etapa de floración. Marque las flores completamente abiertas con hilos de colores para indicar cero días después de la floración. Seleccione las siliconas de 12 a 16 días después de la floración para el siguiente procedimiento. Con unas tijeras finas, corte las silicuas de desarrollo marcadas en el pedicelo y recójalas en tubos de 1,5 mililitros. Prepare un papel de filtro húmedo para la disección para evitar la desecación y coloque la muestra bajo un microscopio estereoscópico. Usando dos fórceps, uno con puntas gruesas para sostener y el otro con puntas afiladas para rasgar. Separe una válvula del replum. Luego, usando las pinzas con las puntas cerradas, recoja suavemente las semillas en desarrollo de las silicuas para evitar dañarlas. Al emplear una aguja de inyección de calibre 27, cree una cicatriz de aproximadamente 0.1 a 0.2 milímetros de tamaño en la testa y el endospermo que rodea al embrión. Sostenga la semilla con fórceps sin aplastarla y haga la cicatriz en la unión de los cotiledones y radicales. Ahora, empuje el embrión pellizcando la semilla con fórceps, teniendo cuidado de no aplastar la envoltura de la semilla y manteniendo su forma redonda. Inserte la aguja de inyección en el sobre de semillas vacío en la cicatriz y perfore de adentro hacia afuera. A continuación, mantenga la aguja en su lugar y use pinzas de punta cerrada para rascar la superficie de la Testa. Luego corte un lado del sobre de semillas para permitir que se abra. Ahora, con unas pinzas de punta afilada, abra el sobre de semillas en una hoja. La muestra aislada ahora debe ser una lámina bicapa compuesta de endospermo y Testa. Coloque las semillas secas de Arabidopsis en un tubo de 1,5 mililitros y agregue un mililitro de agua destilada doble. Mantenga las semillas absorbidas durante al menos 40 minutos a temperatura ambiente. Prepare un papel de filtro húmedo en la platina del microscopio estereoscópico para la disección y, con una micropipeta de 1000 microlitros, transfiera las semillas embebidas al papel de filtro húmedo. Ahora coloque la muestra bajo un microscopio estereoscópico. Con una aguja de inyección, haga una cicatriz de aproximadamente 0,2 milímetros de tamaño en la testa y el endospermo que rodean el embrión. Sostenga la semilla con fórceps sin aplastarla y apunte a la unión entre el cotiledón y el radical para la cicatriz. Ahora empuje el embrión después de pellizcar la semilla con fórceps. Evite aplastar el sobre de semillas vacío y conserve su forma redonda. Con una aguja de inyección, corte los lados superior e inferior del sobre de semillas vacío para darle forma cilíndrica. A continuación, corte la envoltura cilíndrica de semillas a lo largo de su eje central para dividirla en dos trozos. Los resultados deben ser láminas bicapa hechas de endospermo y testa. Coloque las muestras de endospermo aisladas como láminas en un portaobjetos de vidrio y móntelas en agua. Finalmente, coloque suavemente un cubreobjetos sobre la muestra, asegurándose de que la capa de endospermo esté hacia arriba, hacia el cubreobjetos. Use esmalte de uñas o grasa para sellar los bordes del cubreobjetos y evitar la desecación antes de observar la muestra bajo un microscopio. Numerosas células del endospermo y sus estructuras intracelulares se visualizaron con éxito a partir de semillas cosechadas a los 14 días después de la floración utilizando el protocolo de preparación establecido. Se detectaron fotocuerpos dentro del núcleo de las células del endospermo, expresando PHYB-GFP bajo luz blanca, confirmando su presencia y localización nuclear. Las células del endospermo mostraron una formación reversible del fotocuerpo al alternar la exposición a la luz roja y roja lejana, lo que confirma la fotorreversibilidad y la actividad biológica de PHYB hasta 4,5 horas después de la disección. Se realizaron imágenes fluorescentes de lapso de tiempo de mitocondrias en células endospermas intactas después de tres horas de inhibición de semillas y se detectó movimiento mitocondrial. Se observó una motilidad mitocondrial más dinámica en las células del endospermo después de un día de inhibición de la semilla, lo que indica un aumento de la actividad con el tiempo.