Transducción generalizada de neuronas neocorticales de ratón mediante inyección subaracnoidea de AAV2

Nuestra investigación se centra en desarrollar el método que permita la transducción viral de un gran volumen de tejido neural en el neocórtex del ratón. Por lo general, la suspensión de partículas virales se inyecta directamente en el parénquima cerebral. Aquí la transfección del área está determinada por la difusión de las partículas virales en el tejido cerebral, que tienen un rango limitado.

Inyectamos virus vectores virales AAV2 en el espacio subaracnoideo a través de la superficie cerebral. Encontramos que la administración subaracnoidea del virus condujo a un aumento de casi cuatro veces en el área de infección en comparación con la inyección intraparenquimatosa. La nueva técnica proporciona una transducción generalizada de neuronas neocorticales en ratones adultos y ayuda a preservar el tejido cerebral para posteriores registros ópticos o electrofisiológicos de la actividad neuronal.

Nuestro método de inyección permite la expresión selectiva del transgén en una gran capa de población de cinco neuronas piramidales, incluso cuando se utiliza un promotor fuerte no selectivo. Sin embargo, el mecanismo de tal selectividad no se comprende completamente. Para comenzar, asegure los dientes frontales de un ratón anestesiado en la barra de dientes y monte la máscara del animal.

Coloque con cuidado el mouse en las barras de los oídos. Afeite la cabeza desde los ojos hasta detrás de las orejas, luego limpie la superficie afeitada con etanol al 70%, seguido de una solución de yodo al 5% de alcohol. Aplique una solución estéril de lidocaína al 4% por vía tópica e inyecte 0,02 mililitros de dexametasona por vía subcutánea para reducir el dolor y la inflamación.

Con un bisturí estéril y unas tijeras, haga una incisión de cuatro a cinco milímetros en la línea media comenzando entre las orejas para abrir el cuero cabelludo. Expanda la incisión con unas tijeras para evitar daños en el cráneo. Frote la superficie del cráneo con peróxido de hidrógeno al 3% para visualizar bregma y lambda.

Detenga inmediatamente la reacción con solución salina de cloruro de sodio al 0,9%. Luego use un raspador de huesos para eliminar tejido de la superficie del cráneo. Monte el inyector motorizado preparado previamente con una jeringa Hamilton en el brazo estereotáxico.

Ilumine el cráneo expuesto con una fuente de luz quirúrgica y enfoque el microscopio en el bregma. Mirando a través del microscopio, manipule el brazo estereotáctico para alinear la punta de la aguja directamente sobre el bregma. Alinee bregma y lambda horizontalmente usando la punta de la aguja.

Regrese a bregma y registre las coordenadas. Mueva la aguja a las coordenadas calculadas. Bájelo a la nueva posición y márquelo.

Seleccione el sitio para la inyección viral cerca del objetivo mientras considera la propagación viral. Ahora, use una fresa dental estéril de 0.5 a 0.8 milímetros de diámetro para crear una pequeña craneotomía mientras observa a través del microscopio. Use aire presurizado para eliminar el polvo óseo.

Bañe el agujero con solución salina estéril y retire el exceso con un bastoncillo de algodón. Luego use una aguja de calibre 27 con punta en forma de gancho o pinzas finas para eliminar el hueso restante, teniendo cuidado de no dañar la duramadre. Cubre el cráneo con una toalla de papel estéril humedecida con solución salina.

Luego, coloque una película transparente estéril sobre la superficie del cráneo. Mueva el brazo estereotáxico hacia atrás y alinee la aguja de la microjeringa sobre la película transparente. Luego dispense el exceso de aceite hasta que queden dos microlitros.

Pipetear el volumen de inyección viral y otros dos microlitros de virus sobre la película transparente. Mirando a través del microscopio, baje la punta de la aguja hacia el centro de la gota del virus. Ahora cargue el virus en la microjeringa con un inyector motorizado.

Retire el papel humedecido del cráneo y seque el área con un hisopo de algodón. Vuelva a colocar el brazo estereotáxico y la aguja sobre el sitio de inserción. A continuación, dispense una gota de virus para verificar si hay obstrucciones en la aguja.

Haga una pequeña hendidura en la duramadre con una aguja de calibre 30 con una punta en forma de gancho. Baje la aguja de la jeringa a la duramadre y calcule la profundidad de inserción en función del punto de contacto de la superficie. Inserte la aguja lentamente en la corteza a una profundidad de 300 micrómetros, espere de dos a tres minutos, retraiga a 200 micrómetros y espere otros dos o tres minutos.

Comience la inyección viral a 0.06 microlitros por minuto para un total de un microlitro. Después de la infusión, mantenga la aguja en el sitio objetivo durante 10 minutos para permitir la dispersión del virus. Luego retraiga la aguja lentamente para evitar el reflujo.

Dispense una gota de virus para confirmar que la aguja no esté obstruida. Cierre la incisión del cuero cabelludo con suturas absorbibles o no absorbibles 5-0. La administración subaracnoidea de un AAV2 condujo a un área significativamente mayor de infección neuronal en comparación con la inyección intracortical tradicional, con una expansión de casi cuatro veces tanto en dirección mediolateral como rostrocaudal.

La inyección de virus subaracnoideos dio como resultado un fuerte etiquetado fluorescente verde de las neuronas en las capas corticales dos, tres y cinco, mientras que las capas cuatro y seis no mostraron cuerpos celulares etiquetados, pero mostraron dendritas y axones visibles respectivamente. Las partículas fluorescentes que se agregaron a la suspensión del virus inyectado durante la inyección subaracnoidea se encontraron a lo largo de la superficie del cerebro, lo que indica la propagación del virus a través del líquido cefalorraquídeo, con una cobertura de superficie más amplia que el etiquetado neuronal. La gran distribución superficial de fluorescencia verde en las secciones frontales confirmó una infección cortical generalizada después de la inyección subaracnoidea, en contraste con la pequeña infección localizada observada con la inyección estándar.

En las capas supergranulares, una fracción sustancial de las neuronas transducidas coexpresaba parvalbúmina o calbindina, mientras que no se detectaron interneuronas comarcadas en la capa cinco, y todas las células infectadas estaban representadas exclusivamente por neuronas piramidales.