Flujo de trabajo que utiliza un microscopio criogénico de fluorescencia coincidente, electrones y haz de iones para la molienda dirigida de células

Mi investigación desarrolla métodos de microscopía óptica para preservar características celulares en las láminas criogénicas durante el fresado de haces iónicos focalizados, permitiendo un análisis detallado mediante tomografía electrónica criogénica para descubrir la organización biológica nativa. La microscopía óptica se ha integrado en sistemas CrioFIB-SEM, pero rara vez en la misma posición que la FIB. Esto requiere enfoques de guía basados en registro para preservar los objetivos marcados con fluorescencia en la lámina final.

Para empezar, enfría manualmente la estación de transferencia usando nitrógeno líquido una vez que la etapa ha alcanzado temperaturas criogénicas. Carga una autorreja clipada en el casete de muestra diseñado para el sistema de microscopía criogénica de luz. Asegúrate de que la autorejilla esté situada entre el deslizante de la cubierta pegada y el separador.

Aprieta el tornillo del anillo para cerrar el casete e insértalo en la ranura de la estación de transferencia. Conecta la estación de transferencia al sistema de microscopía criogénica. Utiliza la cámara de cámara interna para guiar el casete de muestra hasta la etapa de muestra.

En el software de microscopía óptica, mueve la etapa de muestra desde la posición de carga hasta la posición predefinida de tres hazos. En el software FIB-SEM, ajusta la ampliación a 100X y haz clic en la ventana superior izquierda. En la pestaña de alineación del software de microscopía óptica, haz clic en la Z y selecciona la función Play para obtener un atlas SEM de la cuadrícula.

Identifica un área cuadrada con película de carbono rota y haz doble clic en ella para mover la etapa de muestra a esa ubicación. Vuelve a la interfaz del software. Activa la FIB y adquiere una imagen.

Ajusta la ampliación usando el menú desplegable en la esquina superior izquierda. Pulsa Play para mostrar la imagen FIB. Luego ajusta el tamaño del paso usando la barra deslizante.

Ahora haz clic en Z y Z para ajustar la posición de la etapa Z hasta que la línea horizontal presente en el ion y las imágenes electrónicas se alineen con la misma característica. Selecciona la pestaña SEM en el software de microscopía óptica. Utiliza los botones X e Y para alinear una característica común entre las imágenes SEM y las iones.

Ahora enciende el microscopio de fluorescencia. Selecciona la pestaña FLM, establece condiciones de imagen de luz reflejada y selecciona Reproducir. Luego alinea la imagen de luz reflejada con la imagen SEM.

Haz zoom en la imagen y haz clic en la opción rectángulo para definir un patrón de fresado para el haz iónico. Pulsa Start Patterning en la pantalla 2 para fresar un patrón pequeño usando el haz de iones enfocado. Confirma que el patrón fresado es visible tanto en la vista del haz de iones enfocado como en la del microscopio fluorescente.

En el software de microscopía óptica, muévete a la pestaña de Localización y activa las condiciones adecuadas para configurar los canales fluorescentes. Asigna a cada fluoróforo a un canal separado e incluye un canal adicional para campo claro. Ajusta la potencia del LED y el tiempo de exposición de cada canal fluorescente para identificar el objetivo de interés.

Una vez que los parámetros sean satisfactorios, adquiere una pila z fluorescente de pre-fresado siguiendo la dirección axial. Luego marca el objetivo como una región de interés. Cambia al software FIB-SEM y dibuja una lámina en la región de interés.

Realiza fresado en bruto para eliminar el material grueso mientras mantienes encendido el microscopio de fluorescencia para monitorizar los cambios de señal. Abre el kit de herramientas interferométricas basado en Python desde el terminal para monitorizar la señal fluorescente durante el adelgazamiento de láminas. Reduce el ROI a aproximadamente dos micrómetros usando el modo de sección transversal de limpieza.

Para un objetivo con una extensión axial superior a 300 nanómetros, en la interfaz gráfica de Python selecciona el objetivo en la micrografía de fluorescencia. El software comenzará automáticamente a graficar el brillo en función del tiempo con cada nuevo fotograma. Monitoriza la intensidad de la fluorescencia a través del kit de herramientas de Python.

Fresa la muestra usando el modo de sección transversal de limpieza para eliminar cualquier película de soporte restante por debajo de la región de interés. Observa caídas bruscas en la intensidad de la fluorescencia como señales para cambiar la dirección de fresado. Si se observa una disminución pronunciada al fresar de abajo hacia arriba, detente y comienza a fresar de arriba hacia abajo.

Tras completar el fresado de arriba hacia abajo, finaliza la lámina fresando de abajo hacia arriba en modo de sección transversal de limpieza hasta alcanzar el grosor deseado. Luego toma una imagen de fluorescencia post-fresado de la lámina. Transfiere la muestra a un CryoTEM.

Carga la imagen de fluorescencia multicanal post-fresado y la imagen de proyección CryoTEM en el software personalizado de transformación proyectiva para el registro de regiones de interés. Ahora selecciona entre ocho y diez pares de puntos de referencia visibles tanto en imágenes de fluorescencia como de microscopía electrónica para calcular la transformación proyectiva. Utiliza la imagen superpuesta como guía para seleccionar un área de imagen.

Luego selecciona los parámetros de aumento y adquisición apropiados para la serie de inclinación según el tamaño de la estructura objetivo y la resolución deseada. Las células de macrófagos diferenciadas marcadas con SiR-Tubulina mostraban un único punto fluorescente brillante, de aproximadamente un micrómetro de diámetro, correspondiente al MTOC, junto con estructuras similares a la fibro que irradiaban hacia la periferia celular consistente con la red de microtúbulos. A medida que la muestra se molía hasta un grosor aproximado de 800 nanómetros, el único punto fluorescente MTOC se resolvía en dos motas distintas, cada una de aproximadamente 700 nanómetros de diámetro.

La intensidad de la fluorescencia aumentó tras la retirada del material a granel no fluorescente y la película de soporte absorbente, seguida de una fuerte disminución a medida que la lámina se adelgazaba aún más, pasando de dos micrómetros a menos de 200 nanómetros. La fluorescencia criogénica correlacionada y la microscopía electrónica permitieron un apuntado preciso de estructuras durante el fresado. Tomografías reconstruidas y modelos segmentados revelan que los centriolos están compuestos por tríxeos de microtúbulos.

En los casos en los que solo se retenía una mota fluorescente en la lámina final, se visualizaba un único centriolo en el tomograma correspondiente. La precisión de la fluorescencia basada en el milimilling está limitada por los métodos de registro, que sufren mucho de resolución limitada por difracción, desajuste del índice de refracción y también del movimiento inducido por fresado. La microscopía óptica simultánea y el fresado FIB eliminan errores de registro al utilizar en su lugar la retroalimentación en tiempo real de la microscopía de fluorescencia para guiar el proceso de fresado.

Esto evita errores debido al límite de difracción y al desajuste del índice de refracción, permitiendo un fresado preciso que preserva las estructuras marcadas con fluorescencia para la criotomografía electrónica dentro de la lámina final. Nuestra investigación permite ver estructuras celulares que antes eran difíciles de visualizar directamente mediante crioET, arrojando luz sobre los mecanismos moleculares detrás de un amplio espectro de máquinas micromoleculares clave.