Síntesis de vesículas unilamelares gigantes compuestas: un modelo biomimético de células nucleadas

Este artículo presenta un método para preparar vesículas unilaminares gigantes compuestas (cGUV) con una estructura de vesícula en vesícula, con conductividad eléctrica personalizada en regiones internas, anulares y externas. La electroformación sintetiza GUV simples, que se transforman en estomatocitos y cGUV mediante choque osmótico, proporcionando un modelo valioso para estudiar la biofísica de las células nucleadas.

Hemos realizado un estudio elaborado sobre la síntesis y la electrohidrodinámica de vesículas unilamelares gigantes compuestas para establecerlas como equivalentes biomagnéticos de las células eucariotas. El intento consiste en comprender las tecnologías que implican la aplicación del campo eléctrico a las células biológicas, como la electroporación celular y la electrodeformación celular.

Se emplea una combinación de microscopía de fluorescencia y luz, tratamientos eléctricos de pulso de nanosegundos, osciloscopio y fuentes de energía, y métodos de síntesis innovadores para avanzar en la investigación en esta área. El desafío en la síntesis de GUV compuestos bien formados en la sensibilidad de un método a una temperatura, tipos de lípidos y la composición utilizada. En este trabajo, demostramos esto para un sistema de DMPC y colesterol, pero generalizarlo sigue siendo un desafío. Los GUV simples que imitan las células nucleicas se han sintetizado en la literatura. Sintetizamos la vesícula gigante compuesta para emular células nucleadas con la estructura de defensa de la válvula, encerrando una vesícula interna de aproximadamente la mitad del tamaño de la vesícula externa.

Nos centraremos en estudiar el efecto de los pulsos de micro y nanosegundos en la vesícula interna, que es una imitación del núcleo de una célula biológica en el contexto de la electroporación.

[Narrador] Para comenzar, limpie a fondo los portaobjetos recubiertos de óxido de indio y estaño o ITO con una solución de jabón para platos y enjuague con agua desionizada con una conductividad de 0,055 microsiemens por centímetro. Luego, con una solución de etanol al 100%, limpie los portaobjetos nuevamente y enjuague con agua desionizada. Seque los portaobjetos en un horno a 85 grados centígrados. Identifique el lado conductor de cada portaobjetos recubierto de ITO con una pinza amperimétrica. Asegure la corredera limpia en la etapa del codificador de centrifugación con una aspiradora, asegurándose de que el lado conductor esté hacia arriba. Aplique 25 microlitros de la solución lipídica, una o cuatro gotas en el lado conductor de un portaobjetos ITO. Tome otro portaobjetos y aplique 25 microlitros de la solución lipídica de dos de la misma manera. Seque al vacío ambos portaobjetos recubiertos de lípidos en un desecador almacenado en la oscuridad durante un mínimo de dos horas. A continuación, coloque un portaobjetos ITO recubierto de lípidos con uno lipídico en paralelo con un portaobjetos limpio, asegurándose de que los lados conductores estén uno frente al otro, y coloque un espaciador de caucho de silicona de tres milímetros de espesor entre ellos. Selle la configuración con una abrazadera para crear una cámara de electroformación. Ahora llene la cámara con una solución de sacarosa de 100 milimolares con una jeringa de dos mililitros. Conecte el cable de salida del generador de funciones a las guías recubiertas de ITO con el generador de funciones. Coloque ambas cámaras de electroformación en una incubadora mantenida entre 38 y 40 grados centígrados. Aplique un campo eléctrico de corriente alterna de cinco voltios pico a pico a una frecuencia de 10 hercios utilizando un generador de funciones de doble canal durante cuatro horas. Después de la incubación, desconecte las cámaras de electroformación del generador de funciones. Sácalos de la incubadora y déjalos enfriar a temperatura ambiente. Con una jeringa, coseche las vesículas unilamelares gigantes sintetizadas de cada cámara y transfiéralas a tubos de microcentrífuga separados de dos mililitros. Incube los tubos a temperatura ambiente entre 25 y 27 grados centígrados durante una hora antes de proceder al choque osmótico. Transfiera 200 microlitros de vesículas unilamelares gigantes simples, o sGUV, suspendidas en medios hidratantes que contengan una solución de sacarosa de 100 milimolares a la cámara de observación, e introduzca 125 microlitros de solución de glucosa de 300 milimolares para inducir un shock osmótico e iniciar transiciones de forma. Deje que los sGUV, que ahora están sometidos a un shock osmótico, descansen durante una hora dentro de la cámara de observación colocada en la platina de microscopía. Realice microscopía de contraste y epifluorescencia de interferencia diferencial utilizando un microscopio invertido equipado con una cámara monocromática. Utilice lentes de objetivo de distancia de trabajo extra larga Plan Fluor de 20X por 0,45 y 40X por 0,60 para observar las transiciones de forma en los sGUV. Para la epifluorescencia, use un conjunto de filtros verdes con excitación de 510 a 560 nanómetros, un espejo dicroico de 575 nanómetros y un filtro de barrera de 590 nanómetros para bicapas teñidas de Niall Red. Monitoree las transiciones de forma dentro de la cámara de observación utilizando contraste de interferencia diferencial y microscopía de epifluorescencia con lentes de objetivo Plan Fluor. Observe la formación de vesículas estomatocíticas a medida que avanza la transición de forma. Supervise cómo se asientan primero las vesículas más grandes, seguido de un aumento en el número de vesículas más pequeñas con el tiempo. A continuación, agregue una solución salina para ajustar la conductividad en diferentes regiones de los cGUV antes de inducir un choque osmótico. Por ejemplo, para crear una mayor conductividad en las regiones externa e interna que en la región anular, transfiera 200 microlitros de solución de sacarosa a la cámara de electrofusión. Agregue 20 microlitros de solución salina de 7,5 milimolares en la cámara e induzca un shock osmótico con 125 microlitros de solución de glucosa de 300 milimolares. Deje que los sGUV de choque osmótico descansen en la cámara durante tres o cuatro horas. Confirme que los cGUV resultantes tienen una mayor conductividad en las regiones externa e interna en comparación con la región anular. Para realizar la electrodeformación de los cGUV, separe los electrodos de alambre a 500 micrómetros de distancia y aplique un potencial eléctrico de corriente alterna de 7,5 voltios pico a pico a 100 kilohercios usando un generador de funciones. Después de aplicar el campo eléctrico, capture video a 10 cuadros por segundo y observe la deformación achatada de las vesículas externas y la deformación prolata de las vesículas internas. A continuación, cargue la mezcla de cGUV en un portaobjetos de cavidad y selle con un cubreobjetos para evitar que se mueva. Utilice un microscopio confocal de barrido láser para analizar la morfología del cGUV mediante el escaneo del eje Z con un tamaño de paso de un micrómetro. Emplee una lente de objetivo Plan Apochromat 40X by 1.3 oil DIC para obtener imágenes. Utilice un modo rojo de un solo canal con una excitación de 561 nanómetros y una emisión de 561 a 695 nanómetros para obtener imágenes de cGUV teñidas con rojo Niall o PE rodamina. Modifique y extraiga el archivo . CZI utilizando el software vinculado al microscopio. Inserte gráficos como barras de escala y habilite vistas 2D y 3D. Luego vaya a método de procesamiento y parámetros para ajustar la configuración deseada. Luego haga clic en Aplicar para exportar la imagen en formato JPG. Finalmente, abra el archivo en el software ImageJ. Para insertar una barra de escala, vaya a analizar, seguido de establecer escala para calibrar, luego seleccione analizar seguido de herramientas y barra de escala para aplicarlo. Las imágenes confocales de pila Z confirmaron que las vesículas internas estaban completamente separadas de las vesículas externas y elevadas en el plano Z debido a la menor densidad de la solución interna. El estado intermedio de los estomatocitos mostró un cuello estrecho que conecta las vesículas internas y externas antes de la separación completa. Seis horas después del choque osmótico se observó una población diversa de formas vesiculares, incluidas múltiples vesículas internas, cuerpos en forma de estrella y estructuras tubulares. Se formó una alta abundancia de cGUV utilizando una mezcla lipídica de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina y colesterol en una proporción molar de 63 a 37. Bajo un campo eléctrico de corriente alterna, los cGUV mostraron deformación con la vesícula externa formando una forma achatada y la vesícula interna formando una forma prolata.