Aislamiento y evaluación por citometría de flujo de las interacciones neuroinmunes en un modelo murino de mini-ictus

El alcance de nuestra investigación se centra en la función de las células inmunitarias después de un accidente cerebrovascular isquémico. Nuestro objetivo es comprender las leyes de las células inmunitarias residentes e infiltrantes en la patología del accidente cerebrovascular. Actualmente, la citometría de flujo se usa ampliamente para evaluar la función de las células inmunitarias y las interacciones en las neuroinflamaciones.

Además, las técnicas inmunológicas y la secuenciación y de células individuales están avanzando en la investigación de las interacciones neuroinmunes. Nuestro laboratorio se centrará en ilustrar la ruta de los astrocitos en las interacciones neuroinmunes, las contribuciones de la angio a los procesos neuroinflamatorios. Para comenzar, tome una jeringa de 50 mililitros y coloque una aguja de calibre 26 en su extremo.

Llene la jeringa completamente con solución salina. Coloque el ratón anestesiado en decúbito supino sobre una tabla de espuma. Extienda las extremidades delanteras y traseras y asegúrelas con agujas de calibre 26.

Con pinzas dentadas para el pulgar, agarre la piel abdominal y haga una incisión lateral para exponer el hígado. Corta a lo largo de ambos lados de las costillas para exponer el corazón. Ahora inserte la aguja de calibre 26 en el ventrículo izquierdo y corte el oráculo derecho.

Presione el émbolo de la jeringa para permitir que la sangre drene. Continúe la perfusión hasta que la sangre que drena del oráculo parezca clara. Después de decapitar al ratón y extraer el cerebro, transfiéralo a una matriz cerebral de acero de ratón y secciéndalo en cortes corneales consecutivos de dos milímetros de grosor.

Introduzca 500 microlitros de mezcla de enzimas de digestión en cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Con micropinzas, separe delicadamente el tejido del infarto y transfiéralo a la mezcla de enzimas de digestión. Finalmente, fragmente el tejido con unas tijeras oftálmicas en los trozos más pequeños posibles e incube la placa a 37 grados centígrados durante 20 minutos.

Con la pipeta AP 1000, aspire suavemente y dispense la solución 10 veces para disociar el tejido en células individuales. Luego pase la solución a través de un colador celular de 70 micrómetros. Enjuague repetidamente tanto la placa de 12 pocillos como el colador celular con HBSS helado que contenga calcio y magnesio.

Ahora centrifugue la suspensión celular recolectada a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche con cuidado el sobrenadante sin alterar el gránulo. Vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de PBS.

Después de repetir el proceso de centrifugación, vuelva a suspender el gránulo en 150 microlitros de PBS y transfiera la suspensión a una placa inferior redonda de 96 pocillos. Centrifugar de nuevo a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, sujete firmemente la placa de 96 pocillos e inviértala rápidamente para desechar el sobrenadante.

A continuación, diluya la matriz de fluorescencia de viabilidad celular en una proporción de uno a cien en PBS y vuelva a suspender el gránulo en 150 microlitros de la solución de colorante diluida. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras protege la placa de la luz. Después de centrifugar durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, deseche el sobrenadante.

Diluya el cóctel de anticuerpos de la superficie celular en la clasificación de células activadas magnéticamente o en el tampón máximo y, sin lavar las células, agregue el cóctel de anticuerpos a los pocillos. Incubar durante 15 a 20 minutos a cuatro grados centígrados antes de centrifugar durante cinco minutos más. Después de centrifugar la placa y desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento en 150 microlitros de tampón máximo.

Transfiera la suspensión a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros o tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros. Diseñe un panel de citometría de flujo multicolor de acuerdo con la configuración del instrumento utilizando métodos manuales o una herramienta de diseño de panel en línea. Incluya un tinte de viabilidad celular en el panel para excluir las células no viables y los desechos de los datos.

Ajuste la configuración del detector de dispersión frontal y lateral para asegurarse de que las celdas de interés se muestren correctamente y se puedan cerrar correctamente. Ajuste los parámetros FSC y SSC para eliminar los residuos y el ruido extraño. En un diagrama de puntos que muestra el área FSC frente a la altura, distinga los dobletes de las celdas individuales.

Utilice la señal negativa del colorante de viabilidad para aislar células viables. Compare el control de autofluorescencia de células no teñidas con controles positivos de células teñidas para confirmar que las células teñidas se escalan correctamente para cada parámetro. Ajuste la compensación analizando muestras de celdas multicolores y examinando gráficos de puntos de dos colores.

Ajuste la configuración de compensación hacia arriba o hacia abajo hasta que las poblaciones de celdas se alineen vertical u horizontalmente entre sí. Utilice las señales CD45 y CD11B para distinguir entre linfocitos, microglía, células mieloides y astrocitos en función de sus patrones de expresión específicos. Emplear tejido cerebral simulado como control de autofluorescencia para servir como referencia para identificar linfocitos.

Si analiza un objetivo específico, utilice un control FMO con tejido cerebral posterior al accidente cerebrovascular. Recopile los datos de control y guárdelos. Del mismo modo, recopile los datos de muestra y guárdelos.

Seleccione y clasifique las poblaciones de células objetivo en tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros o tubos de centrífuga cónicos de 15 mililitros. Agregue 500 microlitros de PBS y enjuague el tubo de recolección para preservar la viabilidad celular y ayudar a la formación de gránulos. La microglía CCR7 positiva y CD11c positiva se cuantificó en los días dos y siete después del accidente cerebrovascular isquémico.

La expresión de CCR7 en la microglía aumentó bruscamente el segundo día y se mantuvo elevada el séptimo día en comparación con los controles simulados. La microglía positiva para CD11c siguió una tendencia similar, alcanzando su punto máximo en el segundo día y manteniéndose más alta que la simulada en el séptimo día. Los diagramas de puntos mostraron señales densas de CCR7 y CD11c en los días dos y siete.

Contrastando con señales dispersas en controles simulados. Una estrategia de activación separó las células mieloides de la microglía y los linfocitos utilizando la expresión de CD11B y CD45. Los marcadores adicionales definieron células viables, astrocitos y subconjuntos de linfocitos.