Explorando los eventos celulares secuenciales de fagocitosis desencadenados por Godanti Bhasma en células de mamíferos

Fagocitosis, donde un fagocito ingiere y descompone partículas extrañas. Es crucial para la defensa inmunológica. Se necesitan métodos mejorados y fáciles de usar para monitorear y evaluar de manera eficiente este complejo proceso celular.

La captura de eventos de degradación en tiempo real y la evitación de artefactos del fotoblanqueo siguen siendo desafíos clave para estudiar con precisión la fagocitosis y el tráfico intracelular. A diferencia de las partículas fluorescentes o sintéticas, nuestro protocolo utiliza Godanti Bhasma, una partícula sin etiquetas que permite la visualización directa de las etapas de fagocitosis sin fotoblanqueo, optimización o preparación compleja. Estos hallazgos proporcionan un modelo reproducible para diseccionar los mecanismos fagocíticos, ofreciendo nuevas herramientas para estudiar la dinámica vesicular, la disfunción de patógenos y la posible intervención terapéutica para los trastornos inmunológicos y lisosomales.

Nuestro objetivo es explorar los reguladores moleculares de los fagosomas de maduración, investigar la disfunción fagocítica en modelos de enfermedad y detectar posibles fármacos que modulen la dinámica vesicular y el tráfico intracelular. Para comenzar, pesa exactamente 100 miligramos de polvo Godanti Bhasma o GB. Suspender el polvo en 10 mililitros de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina estreptomicina.

Agite bien la suspensión para mezclar el contenido y deje reposar la mezcla durante un minuto para permitir que las partículas más grandes se asienten en el fondo. Con una pipeta, transfiera los cinco mililitros superiores de la suspensión a un tubo de centrífuga estéril. Etiquete los cinco mililitros de suspensión de GB transferida como la solución madre para el trabajo de cultivo celular adicional.

Vuelva a agitar la suspensión a fondo para garantizar una dispersión uniforme de las partículas antes de agregarla a las celdas. Siembre 3 10 a la cuarta potencia de 3T3-L1 en un plato de 35 milímetros que contenga dos mililitros de DMEM. Incube el plato a 37 grados centígrados en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono hasta que las células alcancen el 70% de confluencia.

Luego mezcle bien 300 microlitros de la suspensión de stock GB en dos mililitros de medio de cultivo fresco precalentado. Coloque la placa de cultivo que contiene las células y la suspensión GB en la incubadora de platina del microscopio de imágenes. Seleccione el objetivo 10x en el microscopio.

Encienda la iluminación de campo claro con el botón Bright. Luego inicie el software DIGI ImagePlus y seleccione la cámara adecuada. Haga clic en el botón Capturar y elija la opción de lapso de tiempo.

Establezca el tiempo de intervalo en cinco minutos y comience a grabar haciendo clic en el botón Finalizar. Capture imágenes de campo claro a intervalos de cinco minutos de forma continua durante 16 a 24 horas dentro de la incubadora de dióxido de carbono de la etapa del microscopio. Utilice el software ImageJ para compilar todas las imágenes capturadas en un video de lapso de tiempo.

Esto permite identificar las etapas de fagocitosis desde la internalización de las partículas hasta su degradación completa. Después de 24 horas de crecimiento celular en placas de 96 pocillos, mezcle bien la suspensión de stock de partículas GB. Agregue 30 microlitros de la suspensión a cada pocillo.

Utilice pocillos sin partículas GB como controles negativos. Incube las placas a 37 grados Celsius en dióxido de carbono al 5% durante 24 horas para inducir la formación de vacuolas. Para preparar una solución de color rojo neutro, disuelva el rojo neutro para formar una solución de 0,5 miligramos por mililitro en DMEM sin sérico.

Filtrar la solución a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Para obtener imágenes, retire el medio de placas de 96 pocillos. Después de agregar 60 microlitros del tinte filtrante a cada pocillo, incube la placa a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Lave los pocillos tres veces con PBS para eliminar el exceso de tinte. Luego proceda con imágenes microscópicas. Examine las vacuolas teñidas bajo un microscopio utilizando el objetivo 20x para evaluar el tamaño, la morfología y el número de vacuolas.

Para preparar la solución madre de bafilomicina A1, disuelva 100 microgramos del compuesto en 50 microlitros de dimetilsulfóxido. Luego dilúyalo con 950 microlitros de DMEM. Para la solución de trabajo, diluir un microlitro del caldo en 1,6 mililitros de DMEM para obtener una concentración final de 0,1 nanomolar.

Mezcle bien la solución de trabajo y agregue 100 microlitros a los pocillos que contienen células en las placas de 96 pocillos. Luego incube las células en cada pocillo con 30 microlitros de suspensión de partículas GB para estudiar la inhibición de la formación de vacuolas y fagosomas. Para inhibir la acidificación de los fagosomas, agregue 100 microlitros de la solución de trabajo de bafilomicina A1 a los pocillos con vacuolas preformadas previamente tratadas con GB. Incube todos los pocillos a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% durante 24 horas.

Agregue 60 microlitros de tinte rojo neutro a cada pocillo. Incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados y lavar los pocillos tres veces con PBS para eliminar el exceso de colorante, luego analizar la formación de vacuolas y la acidificación bajo el microscopio. Tratar las células cultivadas con 50 microlitros de suspensión GB e incubarlas durante la noche a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% en condiciones experimentales estándar.

Después del tratamiento, agregue una solución de naranja de acridina a una concentración de miligramo por mililitro a las células e incube durante 15 minutos a 37 grados Celsius para teñir vacuolas y orgánulos vesiculares ácidos. A continuación, lave las células tres veces con PBS estéril para eliminar cualquier tinte no unido y reducir la fluorescencia de fondo. Finalmente, analice los portaobjetos teñidos inmediatamente utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de 20x y un rango de filtro de excitación azul de 450 a 492 nanómetros.

Evalúe la morfología celular y la absorción de naranja de acridina para comprender la dinámica vacuolar. Después de 30 minutos de tratamiento con GB, se observaron partículas adheridas a la superficie de tres células 3T3-L1. Apareció una extensión de membrana en forma de copa alrededor de la partícula, lo que indica el inicio de la ingestión de partículas.

A las 12 horas después del tratamiento, se observaron grandes vacuolas unidas a la membrana que contenían partículas GB dentro de las células. Las imágenes de lapso de tiempo demostraron la internalización escalonada y la formación de vacuolas en una sola célula viva durante 4,75 horas. Las partículas GB dentro de las vacuolas se degradaron progresivamente con el tiempo y la célula recuperó la morfología normal como lo indica el recambio vacuolar.

El análisis de citometría de flujo mostró que las partículas internalizadas de Godanti Bhasma se degradaron completamente en 24 horas sin que quedaran partículas en el medio de cultivo. La tinción con rojo neutro reveló una acidificación de la vacuola significativamente mayor en las células tratadas con GB de las tres líneas celulares en comparación con los controles que solo mostraron una tinción lisosomal débil. La tinción de naranja de acridina mostró fluorescencia de color rojo anaranjado en las vacuolas de las células GB 3T3-L1, lo que indica acidificación, mientras que las células no tratadas mostraron solo fluorescencia verde.

El cotratamiento con bafilomicina inhibió la formación de vacuolas en las células 3T3-L1 y HeLa, como lo demuestra la ausencia de vacuolas en comparación con sus respectivos controles. Después del tratamiento con bafilomicina, la captación de rojo neutro se bloqueó eficazmente interrumpiendo la acidificación y maduración de la vacuola en las células.