Un canal de brebajes para generar unidades taxonómicas operativas moleculares (MOTU) entre escarabajos ribereños y acuáticos

Buscando acelerar el descubrimiento de especies en los trópicos MEGA diversos, este protocolo tiene como objetivo generar hipótesis de agrupación de especies en escarabajos acuáticos y ribereños utilizando una mezcla de análisis computarizado.

Esta línea de brebaje, que utilizó la secuencia de ADN COI, ha llevado a una mayor evidencia de una delimitación de especies para el escarabajo balsa del género Anisostena, que anteriormente se erigía solo utilizando datos morfológicos.

Este protocolo busca abordar el impedimento taxonómico de que el descubrimiento de especies a través de la taxonomía basada en la morfología, que se considera el estándar de oro en la sistemática de insectos, a menudo requiere mucho tiempo y es confuso para los escarabajos acuáticos poco estudiados, pero MEGA diversos y altamente discretos.

[Emmanuel] Esta tubería genera hipótesis moleculares accesorias llamadas MOTU, independientemente de si la secuencia ha correspondido a las especies conocidas por secuencias referenciadas, o si las especies no están descubiertas o no descritas.

Con esto, en lugar de diseccionar y comparar cientos de estructuras genitales de escarabajos a la vez, la tubería proporciona una agrupación preliminar en la que se pueden examinar los especímenes para determinar su conespecificidad.

[Narrador] Para comenzar, inicie MEGA X y cargue las secuencias de ADN para alinearlas. Abra la interfaz de alineación seleccionando una línea, luego haciendo clic en editar o construir alineación y eligiendo crear una nueva alineación. Haga clic en Aceptar para confirmar la selección y seleccione ADN como tipo de datos. Pase el mouse sobre la pestaña de edición. Haga clic en insertar secuencia desde archivo. Navegue hasta el directorio apropiado y seleccione los archivos de secuencia para cargar en MEGA. Ahora, haga clic en alineación, luego seleccione alinear por ClustalW para alinear las secuencias usando la configuración predeterminada y haga clic en Aceptar para continuar. Para la edición manual de las secuencias, elimine las inserciones haciendo clic en las bases o posiciones insertadas y presionando la tecla Eliminar en el teclado. A continuación, corrija las eliminaciones haciendo clic en el guión que representa una base faltante, eliminándola y escribiendo la base deseada. Luego, encuentre la posición más temprana donde todas las secuencias contienen un carácter. Haga clic en el cuadro en blanco en el encabezado de la fila inmediatamente a la izquierda de esta posición y arrastre para seleccionar todas las posiciones iniciales sobrantes. Presione Eliminar para recortarlos. Luego, busque la última posición alineada y haga clic en el cuadro a la derecha de este punto. Presione Eliminar nuevamente para recortar el final. Ahora, seleccione todas las secuencias y haga clic en la pestaña de secuencias de proteínas traducidas. Cuando se le solicite, verifique el código genético como mitocondrial de invertebrados. Si el código genético es diferente, haga clic en no y aparecerá un menú que le permitirá marcar la casilla del código genético mitocondrial de invertebrados. Si los codones de parada marcados con asterisco en la alineación aparecen en una columna completa, haga clic en secuencias de ADN y elimine la primera posición para todas las secuencias. Nuevamente, haga clic en secuencias de ADN, luego guarde la alineación en formato .mos o .mosx. Para iniciar la delimitación utilizando el módulo TaxonDNA, abra el software TaxonDNA. Haga clic en importar, luego seleccione FASTA y cargue el archivo de alineación en formato FASTA. Ahora, haga clic en módulos, luego seleccione clúster. Establezca el valor del umbral en 3% y marque la casilla etiquetada generar información individual en cada clúster. Haga clic en crear clústeres ahora para comenzar a agrupar y guarde los resultados tomando una captura de pantalla. Para la delimitación utilizando el método Kimura 2-Parameter, abra MEGA y haga clic en archivo, luego seleccione abrir un archivo o sesión. Haga clic en distancia. Seleccione calcular distancias por pares y confirme el archivo .meg para la delimitación. Pase el cursor sobre el cuadro junto al modelo o método y haga clic en la flecha para expandir el menú desplegable. Seleccione el modelo Kimura de 2 parámetros y haga clic en Aceptar para ejecutar el programa. Abra la ventana de salida de datos para ver los resultados. Haga clic en archivo, luego seleccione exportar y copiar distancias para guardar el resultado. Abra las especies ensambladas mediante particionado automático o servidor web ASAP. Haga clic en el cuadro naranja con la etiqueta elegir un archivo y cargue el archivo .fasta. Desplácese hacia abajo y haga clic en ir. Para descargar el resultado de la agrupación en clústeres, haga clic en la lista de la fila con la puntuación ASAP más baja y la clasificación de valor P más alta. A continuación, para iniciar la estimación del árbol, abra MEGA y haga clic en datos. A continuación, seleccione abrir un archivo o sesión para cargar el archivo .meg. Haga clic en modelos, luego seleccione buscar los mejores modelos de ADN y proteínas o ml para determinar el modelo de sustitución que mejor se ajuste. Haga clic en Aceptar en el menú de preferencias de análisis. Ahora, para generar el árbol, haga clic en filogenia, luego seleccione construir y probar el árbol de máxima verosimilitud. Utilice el modelo de sustitución de mejor ajuste haciendo clic en el cuadro junto al modelo o método y seleccionando el modelo apropiado en el menú desplegable. En prueba de filogenia, haga clic en el cuadro junto a la prueba de filogenia, luego elija el método de arranque en el menú desplegable. Haga clic en el cuadro junto al número de replicaciones de arranque. Escriba 1.000 y haga clic en Aceptar para ejecutar el análisis. Una vez que se abra la ventana que contiene el árbol resultante, guarde la sesión como un archivo .mts o .mtsx. También guarde la salida como un archivo .newick y exporte el árbol como una imagen .png. Para la delimitación basada en PTP, visite el servidor web de PTP. Haga clic en elegir archivo y cargue el árbol en formato Newick. Debajo de mi árbol está enraizado selecto. En el cuadro debajo de los nombres de taxones de los grupos externos, ingrese el grupo externo escribiendo el nombre de la punta del taxón. A continuación, en la solución de máxima verosimilitud, haga clic en descargar resultados de delimitación para guardar la salida de PTP ML. Del mismo modo, en la solución compatible con bayesian más alta, haga clic en descargar resultados de delimitación para guardar la salida de PTP BI. Para conocer la limitación basada en MPTP por MPTP, visite el servidor web MPTP. Sube el archivo de Newick arrastrándolo al cuadrado gris o haciendo clic en el cuadrado. Una vez cargados los datos, haga clic en proceder a la selección de grupos externos. En la página de especificación del grupo externo, seleccione el grupo externo haciendo clic en la casilla de verificación junto a las etiquetas de taxones de los especímenes del grupo externo. Luego, haga clic en selección de modelo, seleccione MPTP y haga clic en opciones de visualización. En la página de opciones de visualización, acepte la configuración predeterminada. Haga clic en enviar. Haga clic con el botón derecho en los archivos descargables y elija guardar como para guardar los resultados. Ahora, para generar las unidades taxonómicas operativas moleculares o MOTU, abra el árbol usando un programa de edición de fotos o PowerPoint. Cree una barra para representar los resultados de cada enfoque de delimitación de especies moleculares. Si todos los enfoques arrojan resultados idénticos para un grupo molecular dado, designe el grupo como un MOTU por consenso. Esta figura presenta los resultados de agrupamiento molecular y árbol genético de máxima verosimilitud para los escarabajos borano basados en secuencias COI 3-prime y seis métodos de delimitación. Todos los métodos identificaron consistentemente cuatro MOTUS, Byrrhinus negrosensis, Byrrhinus villarini, Byrrhinus A y Byrrhinus B con agrupamiento idéntico en todos los métodos. Byrrhinus negrosensis y Byrrhinus villarini estaban claramente separados, a pesar de ser originarios de los mismos lugares. Las secuencias de cuatro provincias se agruparon en Byrrhinus A, sin mostrar una fuerte estructuración geográfica. Esta figura muestra la agrupación de escarabajos Anisostena en cuatro MOTUS, incluidos Anisostena angatbuhay, Anisostena auxilium, Anisostena A y Anisostena B con total acuerdo entre los métodos. Anisostena auxilium se superpuso geográficamente con Anisostena A y Anisostena B, lo que indica que la geografía por sí sola no explicaba la divergencia molecular.