In vivo Imágenes de la actividad neuronal en moscas adultas de Drosophila no anestesiadas

Estamos tratando de comprender la base molecular, celular y de circuito del olvido natural de la memoria, con el objetivo de descubrir cómo el cerebro borra o suprime activamente los recuerdos para mantener la flexibilidad cognitiva. Investigaciones recientes han demostrado que el olvido no es simplemente una descomposición pasiva de los recuerdos, sino más bien un proceso biológico activo altamente regulado que requiere patrones específicos de actividad neuronal.

Un desafío importante es vincular manipulaciones de circuitos específicos a procesos de memoria dinámica mientras se integran datos conectómicos, genéticos y de comportamiento de una manera rigurosa e interpretable. Ayudamos a establecer que el olvido es un proceso activo biológicamente regulado. Nuestro trabajo identificó neuronas dopaminérgicas específicas y vías moleculares necesarias para el olvido normal en el cerebro de Drosophila. Nuestro protocolo permite obtener imágenes funcionales en moscas sin anestesia, evitando efectos inespecíficos no deseados por los anestésicos. Utilizamos este enfoque para investigar los correlatos neuronales que subyacen a la formación de la memoria y al olvido activo de la memoria.

[Narrador] Para empezar, utiliza herramientas Dremel y una hoja de sierra de diamante para cortar un tubo de metal hipodérmico de calibre 22 a una longitud de aproximadamente 10 centímetros. Con un disco de corte Dremel 420, pule ambos extremos del tubo para crear una abertura suave y limpia que pueda acomodar la probóscide de la mosca. Envuelva el tubo cortado alrededor de un tubo de centrífuga de 15 mililitros para formar la forma curva deseada. Luego corte un trozo de 7 centímetros de largo de un tubo de metal hipodérmico de calibre 12. Ahora use una cuchilla de afeitar para recortar el extremo de una punta de pipeta de 2 microlitros para que se ajuste al tubo de metal de calibre 22. Coloque el tubo de calibre 12 en el otro extremo de la punta de la pipeta. A continuación, mezcle una pequeña cantidad de resina epoxi y endurecedor. Aplique el epoxi a las uniones donde el tubo metálico pequeño se encuentra con la punta de la pipeta y donde el tubo más grande se conecta al otro extremo. Deje que el epoxi se cure completamente durante la noche antes de conectar el conjunto a un soporte de micromanipulador y ajustar el ángulo según sea necesario. Para crear una pipeta de suministro de golpes y olores, corte 1 mililitro de una pipeta de vidrio de 1 x 100 en la marca de 3 mililitros con una herramienta de diamante Dremel. Luego corte una pequeña lámina acrílica rectangular de 24,5 milímetros x 8 milímetros con un grosor de 1/8 de pulgada. Corta una rejilla de choque de cobre para que encaje en la pieza acrílica rectangular. Suelde dos cables eléctricos a los extremos opuestos de la rejilla de cobre. Ahora coloca la rejilla de cobre sobre la pieza acrílica y dóblala ligeramente para acomodar el abdomen y las patas de la mosca. Usa cinta aislante para unir la rejilla de cobre a la pieza acrílica. A continuación, utilice una pistola de pegamento caliente para fijar la pipeta de vidrio a la rejilla de choque, asegurándose de que esté recta y centrada. Para construir la cámara de grabación, tome un portaobjetos de microscopio de vidrio como base de la cámara. Mezcle la resina y el pegamento epoxi. Con el pegamento epoxi, coloque imanes de neodimio en las cuatro esquinas de una cámara acrílica negra. Coloque un imán adicional encima de cada imán pegado. A continuación, pegue los imanes recién colocados a un portaobjetos de vidrio con epoxi. Mantenga el ensamblaje en su lugar con clips mientras cura. Retire la punta de la pipeta de 200 microlitros del aspirador. Inserte el aspirador en un vial que contenga Drosophila y aspire una sola mosca en la punta de la pipeta de 1.000 microlitros. Vuelva a colocar la punta de la pipeta de 200 microlitros en el aspirador. Luego, sople y mueva suavemente el aspirador para que la mosca quede inmovilizada de cabeza en la parte superior de la punta de la pipeta de 200 microlitros. A continuación, coloque la cámara de disección en el soporte del manipulador. Conecte la aspiradora al tubo de sujeción de moscas y ajuste el caudal a aproximadamente 500 mililitros por minuto. Ahora mueva el tubo metálico de vacío al centro del campo de visión del microscopio. Aspire suavemente la probóscide de las moscas en el soporte de la aspiradora. Ajuste el manipulador para alinear la cabeza de la mosca con la abertura de la cámara. Encienda la fuente de alimentación de corriente continua. Con alambre de resistencia de platino, aplique ácido mirístico derretido para pegar los ojos y el tórax a la cámara. Una vez asegurado, desconecte el tubo de vacío. Retire la cámara de grabación de la conexión de vacío con el manipulador y dé la vuelta a la cámara. Luego pegue la probóscide desde abajo usando resistencia de platino. Cuando todo esté pegado, apague la fuente de alimentación de corriente continua. Luego gire la cámara en posición vertical. Fije la cámara a la base del portaobjetos de vidrio. Corta un pequeño trozo de cinta adhesiva con unas tijeras y colócalo delante y detrás de la cabeza de la mosca. Gire la cámara para que la cabeza de la mosca mire hacia el experimentador en un ángulo de 90 grados. Con una aguja de disección, haga incisiones verticales a lo largo de los lados de los ojos. Gire la cámara horizontalmente. Luego haga un corte horizontal a través de la cutícula. Ahora agregue 100 microlitros de solución salina en la parte superior de la cabeza de la mosca. Con unas pinzas afiladas, retire la ventana de la cutícula y luego retire cualquier resto de grasa o tráquea con las pinzas. Coloque una mosca preparada en la platina del microscopio de un microscopio confocal equipado con un láser y un objetivo de inmersión en agua. Con un micromanipulador, ajuste la posición de la rejilla de choque y la pipeta de olor para que la mosca esté colocada correctamente en la rejilla de choque. Utilice la perilla de ajuste z del curso para escanear a través del eje z del cerebro y localizar la región cerebral de interés. Establezca el tamaño del fotograma en 512 x 512 píxeles. Comience a grabar desde la neurona de interés utilizando un sistema de entrega de olores hecho a medida o disponible comercialmente. Establezca la duración de la grabación en 2 minutos. Inicie el protocolo de entrenamiento utilizando el sistema de entrega de olores 5 minutos después de recopilar las respuestas previas al entrenamiento. Luego, registre las respuestas posteriores al entrenamiento unos 5-15 minutos después del entrenamiento. El indicador de calcio GCaMP6f y la proteína fluorescente roja tdTomato se expresaron selectivamente en la neurona de salida del cuerpo del hongo con dendritas que se proyectan en los lóbulos gamma y alfa del cuerpo del hongo, y la neurona se visualizó utilizando la línea controladora MB077C split-GAL4. Las respuestas de calcio en la neurona de salida del cuerpo del hongo a 3-octanol se redujeron significativamente 5 minutos después del acondicionamiento reversivo sin anestesia y permanecieron suprimidas a los 15 minutos. Por el contrario, las respuestas de calcio al 4-metilciclohexanol mejoraron significativamente 5 minutos después del entrenamiento y permanecieron elevadas a los 15 minutos. Las imágenes en pseudocolor demostraron distintos cambios de fluorescencia antes y después del entrenamiento. En moscas anestesiadas, las respuestas de calcio posteriores al entrenamiento a CS+ solo se redujeron parcialmente y las respuestas a CS- no fueron significativamente diferentes de la línea de base. El análisis cuantitativo confirmó que la respuesta CS+ se deprimió significativamente después del entrenamiento en moscas anestesiadas, pero las respuestas CS- permanecieron estadísticamente sin cambios. La plasticidad fue significativamente mayor en las moscas no anestesiadas en comparación con las anestesiadas.