Herramienta reutilizable de imagen hepática: Una herramienta reutilizable impresa en 3D para microscopía intravital hepática

El objetivo general de este procedimiento es mostrar la Herramienta Reutilizable de Imagen Hepática, o RHIT, como una herramienta innovadora para capturar datos biológicos dinámicos y de alta calidad, especialmente en la investigación hepática. Los métodos científicos tradicionales para estudiar ratones en experimentos controlados han dependido durante mucho tiempo de la observación conductual, el monitoreo fisiológico y el análisis genético. La complejidad de estos estudios suele dar lugar a resultados de datos inconsistentes o limitados.

Muchos experimentos se basan en datos que son incompletos o difíciles de interpretar, como breves destellos de imágenes de baja resolución que se desvanecen rápidamente, dificultando capturar tendencias a largo plazo o cambios sutiles. Presentamos RHIT, que permite una captura dinámica y de alta resolución para la investigación hepática y más allá. La técnica que demostramos permite la fabricación de herramientas de imagen personalizadas utilizando materiales accesibles y tecnología de impresión 3D ampliamente disponible.

Diseñado para su uso en entornos académicos y con recursos limitados, este enfoque permite el desarrollo y despliegue rápido de dispositivos que soporten imágenes in vivo de alta resolución. Nuestra Herramienta Reutilizable de Imagen Hepática, o RHIT, fue desarrollada para mejorar la estabilidad tisular durante la microscopía intravital del hígado. El diseño modular de RHIT acomoda ratones de varios tamaños y permite una ampliación de la imagen de procesos metabólicos dinámicos con mínimas alteraciones fisiológicas.

El RHIT se fabrica en una sola etapa utilizando acrilonitrilo, butadieno, estireno, ABS, un termoplástico seleccionado por su ligero peso, termoestabilidad y durabilidad mecánica. Al ajustar la densidad del material, la RHIT absorbe eficazmente el movimiento causado por la respiración y el latido cardíaco, reduciendo así los artefactos de imagen y mejorando la claridad. La inercia química y la insolubilidad en agua del ABS garantizan la disponibilidad con tejido biológico y permiten una limpieza y reutilización eficientes.

Para recrear RHIT, utiliza un software de diseño de producto 3D. Para este diseño se utilizó Autodesk Inventor. Abre Autodesk Inventor y crea una nueva pieza estándar.

Guarda el archivo con la descripción adecuada. Crea el boceto de RHIT en el plano frontal usando la función de crear boceto 2D. Haz clic en el icono del rectángulo y coloca su esquina inferior izquierda en el origen del plano de boceto.

Dibuja un segundo rectángulo dentro del primero para representar la ventana de imagen de RHIT. Añade dimensiones a ambos rectángulos usando la característica de dimensiones, asegurando que todas las longitudes y anchos se referencian al origen y entre sí. Ajusta las dimensiones del RHIT según el tamaño del ratón.

Añade grosor a RHIT seleccionando solo el rectángulo exterior y extruye el boceto usando la herramienta de extrusión para dejar una abertura en el centro. Selecciona la cara inferior del RHIT extruido y comienza un nuevo boceto 2D usando la función de inicio de boceto 2D. Dibuja un rectángulo para definir el bolsillo de la almohadilla térmica.

Define las dimensiones del rectángulo en función del tamaño y grosor de la almohadilla térmica que se insertará en esta ranura. Estas mediciones deben coincidir con la almohadilla térmica física que se utilizará para asegurar un modelado preciso de la temperatura del mamífero. Aplica las dimensiones requeridas usando la característica de dimensiones.

Sal del boceto 2D y realiza una extracción de material usando la herramienta de extrusión cortada para crear una cavidad profunda para la almohadilla térmica. Haz zoom según sea necesario para posicionar el boceto con precisión. Inicia un nuevo boceto para la sonda de temperatura en la misma cara que la cavidad.

Haz clic en iniciar un boceto 2D y selecciona el icono del círculo. Coloca el círculo sobre la superficie lisa y dimensiona en consecuencia. Sal del modo boceto.

Haz clic en extrusión y selecciona el boceto del círculo. En modo extrusión, haz clic en cortar, extruir y quitar material. Coloca el círculo en el lado derecho de la cara con el inserto de bolsillo.

No necesita estar centrado todavía. Añade dimensiones para alinearlo con el centro del grosor de RHIT. Haz clic en extruida.

Aparecerá una ventana emergente con una flecha que indica la dirección del corte, junto con la opción de atravesar todo. Selecciona a través de todo para cortar todo el material, luego haz clic en "ok". Salir del modo extrusión.

Añade filetes en los bordes de la ventana haciendo clic en el icono de filete y selecciona los ocho bordes afilados. Añade el tamaño del filete y sale del modo filete. Prepara el modelo para impresión 3D navegando a la pestaña de entorno y seleccionando la pestaña de impresión 3D.

Para imprimir el RHIT sin modificar, importa el archivo STL, ya sea de la figura 1A o de los materiales suplementarios, al software de preparación para impresión 3D A. Haz clic en importar, selecciona el archivo y haz clic en preparar para cortar el modelo en capas imprimibles. Elige una impresora 3D comercial compatible y haz clic en imprimir.

Supervisa el proceso de impresión. Una vez terminado, retira y limpia cuidadosamente el RHIT impreso según sea necesario. Espera entre 10 y 15 minutos después de las eyecciones antes de comenzar la cirugía y la imagen.

Preparación para microscopios y uso de RHIT. Prepara un microscopio confocal invertido convencional para IBN hepático, como se muestra en la figura 2A. Inserta el adaptador de escenario para acomodar la muestra.

Para este protocolo, se utilizó un inserto metálico personalizado con una abertura circular de 35 milímetros y un vidrio de tapa de 40 milímetros. Limpia a fondo ambos lados del cristal de la cubierta antes y después de la imagen, usando etanol al 70% según sea necesario. Fija el RHIT adecuado según el tamaño del ratón con cinta alineando la apertura RHIT con la lente objetivo, paralelo al desliz de la cubierta de imagen, como se muestra en la figura 2G, sobre el inserto metálico con cinta sobre el cristal de la cubierta.

Selecciona el objetivo para la imagen en función del tamaño del área, resolución espacial y tiempo de imagen, como un objetivo de agua de 25X por 95. Nivela el objetivo cerca del cristal de la tapa. Sujeta una tira de gasa sobre la ventana mojada con cinta adhesiva.

Esto ayudará a posicionar el tejido y separarlo de otros órganos abdominales. Precalienta la RHIT usando una almohadilla térmica insertada en la ranura y asegura la sonda de calor junto a la RHIT, como se muestra en la figura 2G hasta H. Esto mantendrá la temperatura corporal del ratón durante la imagen. Afeita el pelaje abdominal usando una máquina de cortar pelo y/o crema depilatoria.

Elimina los residuos de pelo y desinfecta la piel expuesta con etanol al 70%. Dependiendo de los requisitos institucionales de la IACUC, puede utilizarse un fregado alterno de Betadina y etanol para asegurar una preparación adecuada del sitio quirúrgico. Reevalúa la profundidad de la anestesia antes de la cirugía en el animal.

Exponer el hígado realizando una incisión horizontal en forma de media luna de dos a tres centímetros bajo la caja torácica con tijeras quirúrgicas desde el xifoides, terminando en el lado lateral izquierdo de la parte superior del abdomen. Tras la incisión inicial, realiza cuidadosamente una incisión secundaria más pequeña en la capa muscular para exponer el lóbulo izquierdo del hígado. Cauteriza según sea necesario para evitar sangrados.

Evita daños por calor al hígado mientras usas el cauterizador colocando una gasa empapada en solución salina entre el hígado y la capa muscular para absorber el calor que emana el músculo. Evita cualquier sangrado excesivo, traumatismos quirúrgicos o mecánicos, o compresión externa. Una vez expuesto el hígado, transfiere el ratón a la etapa de microscopio.

Posicionamiento del ratón en la etapa del microscopio. Coloca el abdomen del ratón anestesiado hacia abajo sobre la plataforma RHIT del microscopio. Ajusta el cono nasal para que el ratón permanezca bajo anestesia.

Utiliza un aplicador empapado en suero salino con punta de algodón para guiar suavemente el lóbulo lateral izquierdo del hígado contra la cubierta mientras aplicas presión externa sobre la cavidad torácica. Aprovecha la gravedad para mover cuidadosamente el hígado hacia fuera y sobre el cristal de la cubierta. Utiliza una tira de gasa para separar suavemente el hígado del cuerpo del ratón.

Revisa de nuevo el cono nasal para asegurarte de que el ratón permanece bajo anestesia durante la imagen. Previene la deshidratación de los tejidos aplicando un gel a base de agua alrededor de los bordes de la cavidad expuesta y evitando el contacto directo con la almohadilla térmica. Un microscopio con una cámara de humedad cerrada también puede ayudar a mantener la temperatura y la humedad.

Aplica pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad corneal. Por último, prepara una IVM en timelapse para comenzar la imagen. Abrir obturadores láser, evaluar el marcado fluorescente e identificar una región estable de interés con un flujo sanguíneo notable.

Selecciona las adquisiciones de imagen adecuadas, incluyendo formato, velocidad, intervalos de imagen, duración del tiempo, media de fotogramas, etcétera. Define límite superior e inferior para los Z-stacks si es necesario, y comienza la grabación en timelapse. Para validar nuestro protocolo, cuantificamos la estabilidad de la imagen usando el índice de similitud estructural, o SIM, mostrado en la figura 3D.

SIM compara dos imágenes basándose en luminancia, contraste y patrones estructurales. Un valor de uno indica similitud perfecta, mientras que cero refleja distorsión. La Figura 3C muestra que RHIT proporciona consistentemente los valores SIM más altos, hasta 50 veces mayores que no insertar, demostrando una calidad de imagen superior.

En imágenes etiquetadas de la A a la C, comparamos la FIV hepática sin estabilizador, con el cartón insertado, y con RHIT. La RHIT mantiene una resolución clara de gotas lipídicas en magenta, núcleos en verde y vasculatura en cian. Los insertos en blanco y negro resaltan la estabilidad de la imagen.

RHIT también permitió el IBM a largo plazo en ratones obesos durante más de ocho horas, como se muestra en la primera película. En conjunto, estos resultados confirmaron que la RHIT mejora significativamente la calidad de la imagen y la reproducibilidad en todas las condiciones. En conjunto, RHIT simplifica la compleja configuración tradicionalmente requerida para la IBM hepática, mejorando tanto la reproducibilidad como la accesibilidad.

Este enfoque anticipa un movimiento más amplio hacia el aprovechamiento de la impresión 3D para la estandarización de protocolos avanzados de imagen. Más allá de la imagen hepática, los principios de diseño de RHIT pueden extenderse a otras aplicaciones, incluyendo tomografía de órganos, ciencia de materiales e ingeniería, donde la estabilidad del movimiento es fundamental para la fidelidad de la imagen.