Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos asociados al cáncer de próstata

Este protocolo proporciona un procedimiento integral para aislar, expandir e inmortalizar fibroblastos de prostatectomías radicales. Además, describe ensayos desarrollados para evaluar los efectos funcionales de la diafonía fibroblasto-células tumorales, aprovechando tanto el tratamiento con medio condicionado como el cocultivo.

Nuestro objetivo es comprender el mecanismo por el cual los fibroblastos asociados al cáncer contribuyen a la progresión tumoral en el cáncer de próstata con el objetivo de neutralizar esta diafonía como estrategia terapéutica. Se pueden evaluar distintas poblaciones de CAF con diferentes propiedades en organoides 3D obtenidos utilizando células tumorales y estromales mediante diversas manipulaciones. Nuestro protocolo permite generar CAF de forma fiable para estos fines.

Los principales desafíos son el aislamiento confiable de células tumorales y normales de los mismos microambientes de pacientes, la heterogeneidad, la ausencia de marcadores específicos de CAF, la plasticidad de los CAF y los modelos in vitro limitados que recapitulan la complejidad de TME. Con métodos similares, caracterizamos el papel protumoral fundamental del factor de transcripción STAT3 y sus genes diana en los CAF de cáncer de mama murino, demostrando su eficacia como dianas terapéuticas. Un aislamiento óptimo de fibroblastos del tumor y las regiones normales adyacentes de muestras de prostatectomía radical obtenidas de pacientes con cáncer de próstata usando una pequeña cantidad de tejido.

Para comenzar, pese las muestras de tejido en la balanza el primer día para el aislamiento de fibroblastos. Con pinzas estériles, transfiera el tejido en platos de seis centímetros. Lave el pañuelo dos veces en cuatro mililitros de PBS helado y dos veces en cuatro mililitros de DMEM completo helado.

Ahora, transfiera el tejido a una placa de seis centímetros sobre hielo. Agregue un mililitro de DMEM suplementado con antibióticos al plato. Luego, use tijeras o cuchillas para picar el tejido en fragmentos de menos de un milímetro cuadrado.

Transfiera el tejido picado a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de DMEM completo helado. A continuación, centrifugar la suspensión a 754 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Con una pipeta de 10 mililitros, retire el sobrenadante.

Vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de DMEM completo helado y centrifugar nuevamente. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en una solución de colagenasa II. Transfiera la suspensión a microtubos de 1,5 mililitros.

Sellar los microtubos con film de parafina. Luego colóquelos a 37 grados Celsius para una digestión nocturna con balanceo continuo durante ocho a 12 horas. Al día siguiente, transfiera las muestras digeridas a tubos cónicos de 15 mililitros.

Pipetear cinco mililitros de DMEM completo helado para inactivar la colagenasa. A continuación, centrifugar la suspensión a 754 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender el sedimento en un mililitro de tripsina-EDTA al 0,05% después de pipetear el sobrenadante.

Incube durante cinco minutos a 37 grados centígrados con agitaciones ocasionales. A continuación, pipetee un mililitro de solución de DNasa I recién preparada a las muestras y mezcle bien. Después de centrifugar y eliminar el sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento en cinco mililitros de DMEM completo en frío y centrifugue nuevamente.

Resuspender las células resultantes en DMEM completo suplementado con suero bovino fetal al 20%. Coloque las células en placas e incube a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y un 95% de humedad durante al menos tres días. Después de tres días, examine las células para determinar su morfología y viabilidad.

Una vez que las células alcancen la confluencia, páselas a un plato de 10 centímetros que contenga DMEM completo con suero bovino fetal al 20%. Fibroblastos asociados al cáncer de placa o fibroblastos normales al 70% de confluencia en placas de 12 pocillos. Al día siguiente, agregue 0,45 gramos de agar de bajo punto de fusión a 12,5 mililitros de PBS en un tubo cónico de 50 mililitros en condiciones estériles.

Disuelva la mezcla usando un horno microondas. Enfríe la solución de agar a 37 grados centígrados. Luego diluya en una proporción de uno a cuatro con DMEM completo precalentado para preparar una solución de trabajo.

Aspirar el medio de la placa de 12 pocillos. Pipetear 500 microlitros de la solución de agar de trabajo en cada pocillo. Incubar durante 20 minutos a cuatro grados centígrados para permitir la solidificación del agar.

Mientras tanto, mantenga la solución de agar restante a 37 grados centígrados. Tripsinizar las células tumorales y preparar una suspensión celular de 20.000 células por mililitro. Mezcle volúmenes iguales de la suspensión de células tumorales y la solución de agar para obtener un volumen final de siete mililitros, lo que representa tres réplicas técnicas por cada condición.

Pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurar una mezcla uniforme. Luego dispense 500 microlitros de esta mezcla que contiene aproximadamente 5, 000 células sobre la capa base solidificada en cada pocillo. Después de dejar que el agar se solidifique durante 20 minutos a cuatro grados centígrados, agregue un mililitro de DMEM completo a cada pocillo.

Cambie el medio cada dos días aspirando suavemente desde el borde del pozo y agregando medio fresco al centro. Incube hasta que las colonias sean fácilmente visibles. Una vez que las colonias sean visibles, deseche el medio de cultivo.

Luego tiña las colonias con 200 microlitros de solución de cloruro de tetrazolio azul nitro. Incube durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada. Al día siguiente, deseche la solución de tinción.

Adquiera imágenes de colonias teñidas con un microscopio estereoscópico. Los fibroblastos puros se aislaron con éxito. En muchos casos, particularmente en los primeros pasajes, los fibroblastos asociados al cáncer mostraron una morfología más fusiforme en comparación con los fibroblastos normales.

El análisis cuantitativo confirmó que la proliferación de células DU145 tratadas con medios acondicionados para fibroblastos asociados al cáncer fue significativamente mayor durante 120 horas que las tratadas con medios acondicionados con fibroblastos normales o sin tratar. Las células DU145 cocultivadas directamente con fibroblastos asociados al cáncer y fibroblastos normales también mostraron una mayor proliferación durante 96 horas en relación con los controles. Las curvas de crecimiento correspondientes demostraron que el cocultivo con fibroblastos normales y asociados al cáncer dio lugar a un aumento similar en la proliferación de DU145 a lo largo del tiempo.

El efecto de los medios condicionados sobre la proliferación de DU145 varió entre los pares de fibroblastos asociados al cáncer y los fibroblastos normales, y los pares de paso tempranos mostraron efectos significativamente más fuertes que los posteriores. En los ensayos de formación de colonias de agar blando, tanto los fibroblastos asociados al cáncer como los normales aumentaron el número y el tamaño de las colonias de DU145 en comparación con los controles, lo que indica un mayor crecimiento independiente del anclaje. Las capas de fibroblastos desprendidas formadas debido a problemas técnicos impidieron la formación de colonias en algunas réplicas.

Los medios condicionados por sí solos no promovieron la formación de colonias independientes del anclaje en las células DU145.