Name: Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos asociados al cáncer de próstata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a aislar, cultivar y caracterizar fibroblastos asociados al cáncer de próstata (CAFs) a partir de especímenes de prostatectomía radical. Este protocolo permite evaluar las interacciones funcionales entre fibroblastos y células tumorales para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.

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<table><tbody><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>833921</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>833922</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>833920</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>833924</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho de ratón anti-GAPDH (6C5)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CB1001</td><td>Fuente: Mouse; Dilución para WB: 1:1000</td></tr><tr><td>AMNa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5228&nbsp;</td><td>Fuente: Mouse; Dilución para WB: 1:3000</td></tr><tr><td>Caveolina</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>CST3267</td><td>Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:1000</td></tr><tr><td>CD31-VioBlue</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-119-980</td><td>Citometría de Flujo Ab, Marcador de Células Endoteliales</td></tr><tr><td>CD326-PE (EpCAM)</td><td>Milteny Biotec</td><td>130113-826</td><td>Citometría de flujo Ab, marcador de células epiteliales</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-110769</td><td>Citometría de flujo Ab, marcador leucocitario Pan</td></tr><tr><td>CD90-APC</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-114-903</td><td>Citometría de flujo Ab, marcador de fibroblastos</td></tr><tr><td>Colágeno VI (COL6A1)</td><td>Abcam</td><td>AB182744</td><td>Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:1000</td></tr><tr><td>Tubo cónico 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62547254</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos Cryopure de 2 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72380992</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 100 mm de diámetro</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 100 mm de diámetro</td><td>Corning</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 60 mm de diámetro</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma Aldirch</td><td>D8418</td><td>Uso en una campana biológica</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila modificada' s Medio (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica</td></tr><tr><td>FAP</td><td>Abcam</td><td>AB53066</td><td>Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:500</td></tr><tr><td>Reactivo de bloqueo de FcR, humano</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-059-901</td><td>Bloqueador de Fc</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica</td></tr><tr><td>Puntas filtradas 10 &micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>703010255</td><td></td></tr><tr><td>Puntas filtradas 100 &micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>703030255</td><td></td></tr><tr><td>Puntas filtradas 1000 &micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>703060255</td><td></td></tr><tr><td>Puntas filtradas 20 &micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>703030265</td><td></td></tr><tr><td>Puntas filtradas 200 &micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>703031255</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S Plus 0,20 &micro; m&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>831826102</td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td>2Biol</td><td>1102412</td><td></td></tr><tr><td>FSP1/S100A4</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>D9F9D (13018)</td><td>Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:2000</td></tr><tr><td>IL6</td><td>Tecnología Abclonal</td><td>A0286</td><td>Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:1000</td></tr><tr><td>ImagenJ</td><td>Instituto Nacional de Salud</td><td>Versión 1.53c</td><td>Software para el análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos Incucyte ImageLock</td><td>Sartorio</td><td>BA-04857</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte&reg; SX5</td><td>Sartorio</td><td>SX5</td><td>Instrumento de análisis de células vivas&nbsp;</td></tr><tr><td>Reactivo de transfección Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Reactivo de transfección mediado por lípidos catiónicos</td></tr><tr><td>MACS&reg; Solución de almacenamiento de tejidos</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-100-008</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas (absorbancia de 600 nm)</td><td>Promega</td><td>GM3500</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos 1,5 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>7269001</td><td></td></tr><tr><td>NCAD</td><td>Abcam</td><td>AB18203</td><td>Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:1000</td></tr><tr><td>Nitro Blue Tetrazolium&nbsp;</td><td>Sigma Aldirch</td><td>N5514</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp;</td><td>Sigma Aldirch</td><td>HS234526B</td><td></td></tr><tr><td>pBABE-puro-hTERT</td><td>Addgene</td><td>1771</td><td>Almacenar a -20 &grados; C, uso en una campana biológica</td></tr><tr><td>pCL-Ampho</td><td>Novus Biological&nbsp;</td><td>NBP2-29541</td><td>Almacenar a -20 &grados; C, uso en una campana biológica</td></tr><tr><td>PDGFRB</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-432</td><td>Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:1000</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (PS, 10,000 &mu; g/mL)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica</td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fases&nbsp;</td><td>Olimpo&nbsp;</td><td>BX42</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Casero</td><td></td><td>NaCl, 137 mM; KCl, 2,7 mM; Na2HPO4, 10 mM;KH2PO4, 1,8 mM. Autoclave y Tienda en RT</td></tr><tr><td>Solución de poli-L-lisina</td><td>Sigma Aldirch</td><td>P8920</td><td>Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica</td></tr><tr><td>Clorhidrato de puromicina</td><td>Sigma Aldirch</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Balanza semimicro Secura</td><td>Sartorio</td><td>SECURA125-1S</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica 10 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>861254001</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica 2 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>861252001</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica 25 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>861256001</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica 5 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>861253001</td><td></td></tr><tr><td>ESTADÍSTICA3</td><td>CST</td><td>9139</td><td>Fuente: Mouse; Dilución para WB: 1:1000</td></tr><tr><td>STAT3 Y705</td><td>CST</td><td>9131</td><td>Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:1000</td></tr><tr><td>microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>MZ125</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 10 mL</td><td>Pentaferte</td><td>00202260D12</td><td></td></tr><tr><td>TermoMixer</td><td>Eppendorph</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%), sin rojo fenólico</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Vim</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6260</td><td>Fuente: Mouse; Dilución para WB: 1:2000</td></tr><tr><td>Concentrador centrífugo Vivaspin 20</td><td>Sigma Aldirch</td><td>Z614602</td><td>MWCO 10,000 Días</td></tr><tr><td>Tijeras Wagner</td><td>2Biol</td><td>14070-12</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos asociados al cáncer de próstata

Isolation, Culture, and Characterization of Prostate Cancer-Associated Fibroblasts

Los pares CAF y NF de 7 pacientes con CaP de alto grado se aislaron con éxito con este protocolo. La edad de los pacientes en el momento de la cirugía y las puntuaciones de Gleason se resumen en la Tabla 3. Para evaluar la pureza de las poblaciones de fibroblastos derivados, se separaron dos CAF y NF primarios y se tiñeron con los anticuerpos fluorescentes indicados o con yoduro de propidio para evaluar la apoptosis. Los resultados representativos del análisis FACS poste...

Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos asociados al cáncer de próstata

Tumor stroma can be actively shaped by tumor cells to adopt pro-tumorigenic properties, making it a focal point of cancer research. Among the stromal ...

isolation-culture-characterization-prostate-cancer-associated

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Cáncer de fibroblastos asociados (CAF) facilitar la iniciación del crecimiento del tumor y la progresión a través de señalización que promueve la proliferación, la angiogénesis y la inflamación. Aquí se describe un método para aislar poblaciones puras de los fibroblastos normales y CAFS de ratón fresco y tejidos humanos por clasificación de células, usando PDGFR como un marcador de superficie.

Aislamiento de fibroblastos normales y el cáncer asociado-de los tejidos frescos por Clasificación células activadas por fluorescencia (FACS)

El aislamiento de células madre de cáncer (CSC) directamente a partir de tejidos humanos es necesaria para su caracterización biológica. Este manuscrito describe una metodología para el aislamiento de células madre cancerosas de la próstata de los tejidos humanos, mientras que también proporciona consejos sobre la solución de problemas difíciles pasos.

El aislamiento de las células madre del cáncer de muestras de cáncer de próstata humano

Aquí presentamos un protocolo para el cocultivo en tres dimensiones, que es útil para investigar las interacciones multicelulares y la modulación dependiente de la matriz extracelular del comportamiento de las células cancerosas. En este modelo experimental, las células cancerosas se cultivan en geles de colágeno incrustados con fibroblastos asociados al cáncer humano.

Tridimensional Modelo Co-cultura para la interacción tumor estromal

El comportamiento de los fibroblastos subyace en un espectro de entidades clínicas, pero siguen estando mal caracterizadas, en gran parte debido a su heterogeneidad inherente. La investigación tradicional de fibroblastos se basa en la manipulación in vitro, enmascarando el comportamiento de los fibroblastos in vivo. Describimos un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos de piel de ratón que no requiere cultivo celular.

Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS

Aquí, presentamos un método para el establecimiento de un sistema rápido in vitro que apoya el cultivo tridimensional y la posterior diferenciación luminal de las células epiteliales primarias de la próstata.

Un sistema de cultivo en 3D basado en Insertar rápido de filtro para la próstata primario Diferenciación Celular

Este manuscrito describe un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana. Elude la cultura in vitro que era inevitable con el protocolo de aislamiento de uso común a través de culturas explantes. Los subconjuntos de fibroblastos que emanan son funcionalmente distintos y muestran la expresión génica diferencial y la localización dentro de la dermis.

Aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana mediante la clasificación celular activada por fluorescencia

Presentamos un protocolo para aislar los fibroblastos adultos primarios de una manera fácil, rápida y confiable, realizable por principiantes (por ejemplo, estudiantes). El procedimiento combina la digestión del tejido enzimático y la agitación mecánica con ondas ultrasónicas para obtener fibroblastos primarios. El protocolo se puede adaptar fácilmente a requisitos experimentales específicos (por ejemplo, tejido humano).

Aislamiento de fibroblastos para adultos primarios aumentados por ultrasonidos

Utilizando células epiteliales de próstata primarias humanas, informamos de un nuevo método libre de biomarcadores de caracterización funcional de células similares a tallos mediante un ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides. Se describe un protocolo paso a paso para el etiquetado de celdas 2D BrdU, CFSE o Far Red; formación de esferoides tridimensionales; identificación celular similar a un tallo que retiene la etiqueta por inmunocitoquímica; y aislamiento por FACS.

Aislamiento de células similares a tallos de cultivos esferoides tridimensionales

La obtención de una población pura de fibroblastos es crucial para estudiar su papel en la reparación de heridas y fibrosis. Aquí se describe un método detallado para aislar fibroblastos y miofibroblastos de corazones de ratón no lesionados y lesionados seguidos de la caracterización de su pureza y funcionalidad por inmunofluorescencia, RTPCR, clasificación celular asistida por fluorescencia, y contracción del gel de colágeno.

Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos

Este artículo tiene como objetivo proporcionar un protocolo para el aislamiento y cultivo de fibroblastos asociados al cáncer primario a partir de un modelo murino singénico de cáncer de mama triple negativo y su aplicación para el estudio preclínico de nuevas nanopartículas diseñadas para dirigirse al microambiente tumoral.

Aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer primario a partir de un modelo murino singénico de cáncer de mama para el estudio de nanopartículas dirigidas

Se prepararon esferoides tumorales 3D multicelulares con células de adenocarcinoma de pulmón, fibroblastos y monocitos, seguidos del aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) de estos esferoides. Los CAF aislados se compararon con fibroblastos normales para evaluar la salud mitocondrial mediante el estudio del potencial transmembrana mitocondrial, las especies reactivas de oxígeno y las actividades enzimáticas.

Evaluación de la salud mitocondrial en fibroblastos asociados al cáncer aislados de esferoides tumorales de pulmón multicelulares 3D

Aprenda a aislar, cultivar y caracterizar fibroblastos asociados al cáncer de próstata (CAFs) a partir de especímenes de prostatectomía radical. Este protocolo permite evaluar las interacciones funcionales entre fibroblastos y células tumorales para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.

Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos asociados al cáncer de próstata

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