Desorción/ionización láser asistida por matriz guiada por fluorescencia con espectrometría de masas de posionización inducida por láser de células neuronales de rata individuales

Nuestra investigación se centra en el desarrollo de flujos de trabajo de espectrometría de masas MALDI unicelular, guiados por imágenes y de alto rendimiento para revelar la heterogeneidad celular y vincular los perfiles moleculares con la identidad, función y respuesta celular en sistemas complejos.

La instrumentación avanzada, como MALDI-2 y los espectrómetros de masas de alta resolución espacial, permiten el análisis dirigido y espacialmente resuelto de células individuales, mejorando la sensibilidad y ampliando el alcance del perfil molecular en tejidos complejos. Los desafíos actuales incluyen sensibilidad limitada, reproducibilidad entre muestras y análisis de datos complejos. Los datos de MALDI suelen ser escasos y grandes conjuntos de datos con miles de células y cientos de moléculas exigen herramientas computacionales sólidas.

Este protocolo aborda la brecha en los métodos de alto rendimiento para analizar células individuales e incluso orgánulos, lo que permite estudios muy detallados de heterogeneidad y obtiene información sobre la biología y función molecular y celular.

Este protocolo permite un análisis rápido y específico de las células dispersas por el portaobjetos, eliminando la necesidad de manipulación celular o escaneo de área completa y aumentando significativamente el rendimiento.

[Narrador] Para comenzar, enjuague cada portaobjetos con dos o tres mililitros de acetato de amonio 150 milimolar para eliminar los cristales de glicerol y sal que pueden interferir con la microscopía y la aplicación de la matriz MALDI, luego seque los portaobjetos bajo un chorro suave de nitrógeno o déjelos secar al aire por completo. Cargue el portaobjetos seco en la platina del microscopio. Enfoque el microscopio utilizando al menos 10 puntos de apoyo distribuidos uniformemente en todo el portaobjetos. Utilizando filtros adecuados para DAPI e imágenes de campo claro, adquiera una imagen de fluorescencia en mosaico de todo el portaobjetos con un aumento de 5x a 10x, asegurando que los marcadores de referencia en los portaobjetos de microscopía se capturen claramente en la imagen. Une las imágenes en mosaico utilizando un software de microscopía, como ZEN ZEISS. Compruebe que los mosaicos adyacentes verticalmente no estén desfasados. Procese y exporte cada imagen unida como un archivo BigTIFF utilizando el software de microscopía o como un TIFF estándar si el tamaño final de la imagen es inferior a dos gigabytes. Disuelva 20 miligramos de 2,5-dihidroxiacetofenona en 1,5 mililitros de acetona. Coloque las diapositivas en el soporte de la cámara de sublimación, luego coloque el soporte en el aparato de sublimación. Pipetea la solución de matriz disuelta sobre la oblea de cerámica y deja que la acetona se evapore por completo, luego cierra la cámara de sublimación para sellarla. Llene la cámara de refrigerante con un aguanieve helada y colóquela de forma segura encima de la cámara de sublimación. Encienda la bomba de vacío y deje que el sistema se equilibre durante cinco minutos. Comience la sublimación calentando la cámara a 200 grados centígrados durante cinco minutos. Después de cinco minutos, retire el baño de agua helada de la cámara. Encienda la temperatura a 25 grados centígrados y coloque un disipador de calor encima de la cámara. Ventile lentamente la cámara de sublimación para liberar la presión. Abra la cámara y retire con cuidado los portaobjetos. Abra MicroMS y diezme las imágenes de microscopía BigTIFF utilizando la opción de grupo de imágenes para adaptarse a los canales de campo claro y fluorescencia. Vaya a la herramienta Opciones de blob y ajuste el tamaño máximo y mínimo del blob para definir el intervalo de tamaño de blob aceptable. Establezca el umbral del canal de fluorescencia para la detección de manchas. Especifique el valor de circularidad para definir qué tan circulares deben ser las celdas identificadas para su consideración y elija el color. Use la opción Blob Find para detectar blobs. Cuando se le solicite, guarde la lista de blobs con el nombre deseado. Utilice la herramienta Filtro de distancia para establecer la distancia mínima entre cada celda. Pruebe el error a través de puntos de prueba para determinar con precisión el error de desplazamiento. Cargue las correderas en el instrumento con el adaptador de correderas MTP II. Después de regresar a la computadora con MicroMS, acceda a la computadora del espectrómetro de masas a través de una aplicación de escritorio remoto. Si utiliza el instrumento por primera vez, verifique su posición navegando a Herramientas, seguido de Configuración del instrumento. En la ventana emergente, vea el conjunto de coordenadas con sus posiciones X e Y y seleccione cada uno de estos puntos específicos en la geometría del adaptador de deslizamiento II. Actualice las posiciones X e Y en la ventana de MicroMS. Usando la cámara del espectrómetro de masas y los controles de la platina, navegue a una ubicación fácilmente identificable en la diapositiva y copie las coordenadas del instrumento. En MicroMS, ubique la misma posición en la imagen del microscopio, haga clic con el botón derecho e ingrese las coordenadas en la ventana emergente. Redondee las coordenadas a los enteros más cercanos y sepárelos por un espacio. Después de agregar tres puntos de registro, uno de los círculos se volverá rojo, lo que indica que es la posición más desviada del registro. Elimine el punto de registro con Control + clic con el botón derecho e inténtelo de nuevo. En Archivo, vaya a Guardar y luego a Registro para guardar el archivo de registro. Con las manchas visibles en la diapositiva, vaya a Archivo, Guardar y luego a Posiciones del instrumento para guardar el archivo de posición del instrumento, luego usando el software de escritorio remoto, transfiera este archivo a la computadora del instrumento. Abra el archivo XEO personalizado y copie su contenido en el MTP Slide Adapter II . XEO en la computadora del instrumento. Guarde el archivo para actualizar este archivo de geometría con las ubicaciones de las celdas. Haga clic en la pestaña Automatización y seleccione Nuevo para crear una nueva ejecución automática. Arrastre por la región de muestra mostrada para seleccionar las celdas y haga clic con el botón derecho para agregarlas a la lista de análisis. Guarde la ejecución automática y haga clic en Iniciar ejecución automática para comenzar la adquisición. Esta figura ilustra cómo el perfil de espectrometría de masas MALDI-2 de una sola célula revela la heterogeneidad celular basada en lípidos entre y dentro de distintas regiones del cerebro. La aproximación y proyección de variedades uniformes, o análisis UMAP, separó las células por región del cerebro, formando distintos grupos para el cuerpo estriado, el hipocampo y la corteza. La agrupación de Leiden reveló cuatro subpoblaciones celulares basadas en lípidos. Además, se observaron firmas lipídicas específicas del grupo, con distintos perfiles de intensidad en los lípidos anotados. Los espectros de masas de seis células corticales también mostraron una detección consistente de lípidos en los portaobjetos. Además, las células corticales de diferentes portaobjetos mostraron distribuciones UMAP superpuestas, lo que indica efectos de lote mínimos.