Name: Visualización de organoides retinianos de montaje completo con resolución celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a visualizar organoides retinianos completos mediante aclarado óptico e inmunomarcado con microscopía confocal. Este método revela la organización celular tridimensional y conexiones neuronales para estudiar enfermedades retinianas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Preparación de anticuerpos secundarios fluorescentes a medida
NOTA: Este enfoque sirve como alternativa al uso de anticuerpos fluorescentes comerciales (consulte la discusión sobre las ventajas de preparar anticuerpos secundarios fluorescentes). Además, este protocolo se puede utilizar para conjugar fluoróforos con anticuerpos primarios en caso de que se deba realizar inmunofluorescencia directa y el anticuerpo primario fluorescente no esté disponible comercialmente. El control de la relación entre fluoróforos y anticuerpos mediante el ajuste de la cantidad de fluoróforo en la reacción de marcaje produce anticuerpos conjugados más brillantes. Sin embargo, los anticuerpos secundarios hechos a medida son menos estables y la concentración del conjugado resultante es 10 veces menor que la de los anticuerpos fluorescentes comerciales. Este protocolo es una adaptación del trabajo descrito por Bálint et al9.
<ol>
	<li>Disuelva 1 mg del fluoróforo en DMSO anhidro y alícuota en tubos para obtener un final de 0,02 mg de fluoróforo por tubo. Retire todo el DMSO con un concentrador de vacío rápido, funcionando durante 1 h y 30 min. Almacenar alícuotas a -20 ºC protegido de la luz. Para Alexa Fluor 405, el H2O ultrapuro es el disolvente adecuado para fabricar alícuotas.</li>
	<li>Para realizar la reacción de etiquetado, disuelva una alícuota del fluoróforo en 1-10 μL de DMSO (o H2O ultrapuro para Alexa Fluor 405). NOTA: La cantidad exacta de DMSO se determina a través de pruebas de conjugación de control anteriores. Estas pruebas se realizan cuando se va a utilizar un nuevo lote de un fluoróforo (o cuando se está acabando un lote de fluoróforo anterior), o cuando se utiliza un nuevo fluoróforo por primera vez en la conjugación. La prueba de conjugación de control consiste en llevar a cabo reacciones de marcaje con cantidades variables de fluoróforo para determinar la relación óptima entre fluoróforo y anticuerpo en el conjugado. En nuestro caso, la proporción óptima suele estar entre 3 μL y 5 μL.</li>
	<li>Incubar 50 μL de IgG secundaria (o primaria), 6 μL de NaHCO3 1 M y 1-5 μL de fluoróforo durante 40 min a temperatura ambiente (RT) en una plataforma oscilante, protegida de la luz.</li>
	<li>Mientras avanza la reacción, prepare las columnas de exclusión del tamaño de purificación quitando sus tapas y dejando pasar el tampón. Equilibre la columna (una para cada reacción de etiquetado) pasando 3 x 2-3 mL de PBS a través de la columna. En caso de que el último paso de equilibrio termine antes de que termine la incubación, vuelva a colocar las tapas para evitar que se sequen y espere hasta que finalice la reacción de etiquetado. NOTA: Las columnas de exclusión de tamaño de purificación funcionan por gravedad. Asegúrese de que la columna no se seque en ningún momento, o la reacción de purificación no funcionará correctamente.</li>
	<li>Cuando finalice la reacción (paso 1.3), agregue 140 μL de PBS a la reacción de etiquetado para hacer que el volumen sea de aproximadamente 200 μL y vértice. Agregue esta solución al centro de la columna, permita que la muestra ingrese a la columna y, después de que la última gota haya eluido, empuje agregando 550 μL de PBS. Cuando el líquido deje de caer, eluir añadiendo 300 μL de PBS y recogerlo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Calcule la concentración de anticuerpos y las proporciones de marcaje midiendo la absorbancia de la muestra a 280 nm y la absorbancia de los fluoróforos utilizados. Aplique la Ley de Beer-Lambert para determinar la concentración (en molaridad) de la siguiente manera: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> Donde A representa la absorbancia, ε para el coeficiente de extinción molar, y CF280 es una medida de la absorbancia que tiene el fluoróforo específico a 280 nm que sirve como factor de corrección. Entonces, la concentración del anticuerpo es: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> Y la proporción de etiquetado es: 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq3.jpg"></li>
	<li>Almacene los anticuerpos marcados a 4 ºC, protegidos de la luz, hasta 6 meses.</li>
</ol>
2. Marcaje de inmunofluorescencia
<ol>
	<li>Fijar los organoides con un 4% de paraformaldehído (PFA) a RT durante 45 min. NOTA: OPCIONAL: Incubar los organoides con una solución de recuperación de antígenos (pasos 2.2 y 2.3) para mejorar la inmunorreactividad de los antígenos.</li>
	<li>Preparar 40 mL de solución de recuperación de antígenos mezclando 0,117 mg de citrato sódico tribásico dihidratado en H2O ultrapuro y ajustar a pH 9.</li>
	<li>Incubar los organoides con la solución de recuperación de antígenos con una agitación suave (30 rpm) a 60 °C durante 1 h.</li>
	<li>Permeabilizar los organoides con PBST (PBS con 1% Triton X-100) con agitación leve a RT durante 4 h.</li>
	<li>Bloquee los organoides con una solución bloqueante (2% de albúmina sérica bovina (BSA) con 0,1% de Triton X-100) en RT durante la noche (o durante 1 día). NOTA: Las concentraciones de anticuerpos primarios y secundarios dependen del anticuerpo en particular. Para la inmunofluorescencia de muestras de montaje completo, utilizamos una concentración más alta en comparación con las muestras seccionadas. Incubamos el anticuerpo primario a 10 μg/mL que, en la mayoría de los casos, corresponde a 1:100 de la cepa (Tabla 1). Incubamos nuestros anticuerpos secundarios hechos a medida a 20-50 μg/mL.</li>
	<li>Incubar los organoides con los anticuerpos primarios diluidos en solución de lavado (0,1% BSA con 0,1% Triton X-100) a 4 °C durante 2 días con una leve agitación.</li>
	<li>Lave los organoides durante 3 x 15 min en solución de lavado agitando ligeramente a RT.</li>
	<li>Incubar los organoides con los anticuerpos secundarios diluidos en solución de lavado a 4 °C durante 2 días con una leve agitación.</li>
	<li>Lave los organoides durante 3 x 15 min en solución de lavado agitando ligeramente a RT. NOTA: Después del inmunomarcaje, se pueden incubar los tintes fluorescentes de elección. Normalmente utilizamos marcadores de núcleos fluorescentes, como DAPI (1:1.000) y DRAQ5 (1:500), o faloidina (1:100) para visualizar la red de filamentos de actina.</li>
	<li>Incubar los organoides con los colorantes fluorescentes diluidos en solución de lavado a RT durante 1 h con una leve agitación.</li>
	<li>Lave los organoides durante 3 x 15 min en solución de lavado agitando ligeramente a RT.</li>
</ol>
3. Aclarado óptico con FluoClear BABB
NOTA: El 1-Propanol podría comprometer los envases de plástico, especialmente para la exposición a largo plazo. Para estar seguro, use recipientes de vidrio.
<ol>
	<li>Paso de deshidratación<ol>
		<li>Prepare soluciones de 1-propanol en H2O ultrapuro en los porcentajes indicados (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) y luego ajuste a pH 9.5 con trimetilamina. PRECAUCIÓN: La trietilamina es tóxica si se inhala. Trabaje debajo de una campana extractora. Las soluciones se pueden reutilizar si se almacenan correctamente (recipiente bien sellado). Ajuste el pH antes de usar.</li>
		<li>Incubar las muestras con el gradiente creciente de soluciones de 1-propanol (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) durante 2 h cada una a 30 °C con una agitación suave.</li>
		<li>Incubar las muestras con 100% de 1-propanol durante la noche a 30 °C con una leve agitación.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Paso de compensación PRECAUCIÓN: BABB es una potente mezcla de solventes que es conocida por su capacidad para disolver o dañar significativamente muchos plásticos. Para estar seguro, use recipientes de vidrio con tapas compatibles y trabaje dentro de una campana extractora.<ol>
		<li>Prepare el BABB mezclando alcohol bencílico (BA) y benzoato de bencilo (BB) en una proporción de 1:2.</li>
		<li>Sumerja las muestras en BABB en RT durante la noche.</li>
		<li>Antes de tomar imágenes, actualice el BABB. NOTA: Para organoides de ~ 1 mm de diámetro, BABB induce un efecto de limpieza que es evidente en decenas de minutos. Dependiendo del tamaño y la naturaleza de la muestra, el grado de aclaramiento puede ser diferente y/o requerir un tiempo de exposición más prolongado a la solución de aclarado. Recomendamos adquirir imágenes antes y después de la inmersión en BABB para mejorar el protocolo de limpieza.</li>
		<li>Almacene las muestras aclaradas de BABB con la solución de BABB a largo plazo a 4 °C. Proteger de la luz para preservar la fluorescencia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Adquisición de imágenes de montaje completo
<ol>
	<li>Con una pipeta de vidrio, coloque el organoide en una placa de Petri con fondo de vidrio con una gota de BABB. Asegúrese de que la muestra entre en contacto con la superficie del cubreobjetos. PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de que la gota de BABB que contiene la muestra no entre en contacto con los bordes de plástico del plato, o derretirá el plástico, comprometiendo la muestra y la calidad de las imágenes.</li>
	<li>Utilizando un microscopio de escaneo láser confocal invertido equipado con objetivos de aumento bajo y alto, adquiera imágenes de pila Z para obtener la visión 3D completa de la muestra con detalles celulares. NOTA: Para este estudio, se utilizó un objetivo de aire de 0,4 con apertura numérica (NA) de 10x y un objetivo de NA 1,4 de 63x, con un tamaño de paso de 3,5 μm y 1 μm, respectivamente.</li>
</ol>
5. Procesamiento de imágenes
<ol>
	<li>Recalibre el tamaño del paso de la adquisición de la pila Z teniendo en cuenta la falta de coincidencia del índice de refracción (RI) entre la solución de limpieza y el medio de inmersión.<ol>
		<li>Calcule el tamaño del paso recalibrado de la siguiente manera: 
		<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq4.jpg"> Para una muestra incrustada en BABB, fotografiada con un objetivo de aire con un tamaño de paso de 3,5 μm, será el siguiente: 
		<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq5.jpg" style="opacity: 0.9;"></li>
		<li>Usando ImageJ, cambie la profundidad del vóxel (haga clic en Imagen | Propiedades...) para el tamaño de paso recalculado.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cree proyecciones de imágenes de la pila Z.<ol>
		<li>Usando ImageJ, inspeccione la pila Z en profundidad (haga clic en Imagen | Pilas | Vistas ortogonales). Aparecerán las vistas XY, XZ e YZ del organoide de la retina.</li>
		<li>Guarde las regiones de interés deseadas (haga clic en Archivo | Guardar como...).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cree una animación del renderizado 3D de la pila Z utilizando un software de procesamiento (consulte la Tabla de materiales).<ol>
		<li>Seleccione los canales que se visualizarán activando sus casillas de verificación.</li>
		<li>Ajuste los planos Z para visualizar el interior de la muestra (active Recorte en la casilla de verificación).</li>
		<li>Grabe la animación usando el editor de películas (habilite el editor de películas en la casilla de verificación). Arrastre y suelte, y acerque y aleje directamente con el mouse. Haga clic en Agregar para incluir un clip diferente para la animación. Si ajusta los planos Z, habilite la opción Recortar planos (haga clic en Configuración... | marque la casilla Recortar planos ).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lee, Y. J., Jo, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids+from+induced+pluripotent+stem+cells+of+patients+with+inherited+retinal+diseases%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids from induced pluripotent stem cells of patients with inherited retinal diseases: A systematic review.</a> Stem Cell Rev Rep. 21 (1), 167-197 (2025).</li>
<li>Onyak, J. R., Vergara, M. N., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoid+light+responsivity%3A+Current+status+and+future+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal organoid light responsivity: Current status and future opportunities.</a> Trans Res. 250, 98-111 (2022).</li>
<li>O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+A+window+into+human+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: A window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), dev189746(2020).</li>
<li>Wahle, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+spatiotemporal+phenotyping+of+human+retinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multimodal spatiotemporal phenotyping of human retinal organoid development.</a> Nat Biotechnol. 41 (12), 1765-1775 (2023).</li>
<li>Isla-Magrané, H., Veiga, A., García-Arumí, J., Duarri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiocular+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+displayed+retinal%2C+corneal%2C+and+retinal+pigment+epithelium+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Multiocular organoids from human induced pluripotent stem cells displayed retinal, corneal, and retinal pigment epithelium lineages.</a> Stem Cell Res Ther. 12 (1), 581(2021).</li>
<li>Isla-Magrané, H., Zufiaurre-Seijo, M., García-Arumí, J., Duarri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-trans+retinoic+acid+modulates+pigmentation%2C+neuroretinal+maturation%2C+and+corneal+transparency+in+human+multiocular+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">All-trans retinoic acid modulates pigmentation, neuroretinal maturation, and corneal transparency in human multiocular organoids.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 376(2022).</li>
<li>Avilov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+across+multi-dimensional+space+of+tissue+clearing+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">Navigating across multi-dimensional space of tissue clearing parameters.</a> Methods Appl Fluoresc. 9 (2), 022001(2021).</li>
<li>Brenna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tissue+clearing+associated+with+3D+imaging%3A+application+in+preclinical+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical tissue clearing associated with 3D imaging: application in preclinical and clinical studies.</a> Histochem Cell Biol. 157 (5), 497(2022).</li>
<li>Bálint, Š, Verdeny Vilanova, I., Sandoval Álvarez, Á, Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+live-cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Correlative live-cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (9), 3375-3380 (2013).</li>
<li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared%2C+intact+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS One. 10 (5), e0124650(2015).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Wang, Y., Zhang, D. -H., Zhang, J. -Y., Chen, N., Zhi, G. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+synthesis+of+bioactive+ethyl+cinnamate+by+enzymatic+esterification+of+cinnamic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">High-yield synthesis of bioactive ethyl cinnamate by enzymatic esterification of cinnamic acid.</a> Food Chem. 190, 629-633 (2016).</li>
<li>Schellinger, A. P., Carr, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubility+of+buffers+in+aqueous-organic+eluents+for+reversed-phase+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22LCGC+North+America%22%5BJournal%5D)">Solubility of buffers in aqueous-organic eluents for reversed-phase liquid chromatography.</a> LCGC North America. 22 (6), 544(2004).</li>
<li>Jiang, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-III-Tubulin%3A+A+reliable+marker+for+retinal+ganglion+cell+labeling+in+experimental+models+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">β-III-Tubulin: A reliable marker for retinal ganglion cell labeling in experimental models of glaucoma.</a> Int J Ophthalmol. 8 (4), 643-652 (2015).</li>
<li>Guo, J., Walss‐Bass, C., Ludueña, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B2+isotypes+of+tubulin+in+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The β isotypes of tubulin in neuronal differentiation.</a> Cytoskeleton. 67 (7), 431-441 (2010).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TuJ1+%28class+III+%CE%B2-tubulin%29+expression+suggests+dynamic+redistribution+of+follicular+dendritic+cells+in+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue.</a> Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 453-459 (2005).</li>
<li>Fernando, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+brain+and+retinal+organoids+from+confluent+cultures+of+pluripotent+stem+cells+connected+by+nerve-like+axonal+projections+of+optic+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Differentiation of brain and retinal organoids from confluent cultures of pluripotent stem cells connected by nerve-like axonal projections of optic origin.</a> Stem Cell Rep. 17 (6), 1476-1492 (2022).</li>
<li>Belecky-Adams, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax-6%2C+Prox+1%2C+and+Chx10+homeobox+gene+expression+correlates+with+phenotypic+fate+of+retinal+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Pax-6, Prox 1, and Chx10 homeobox gene expression correlates with phenotypic fate of retinal precursor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 38 (7), 1293-1303 (1997).</li>
<li>Rowan, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+homeodomain+transcription+factor+Chx10+in+the+retina+using+a+novel+multifunctional+BAC+transgenic+mouse+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the homeodomain transcription factor Chx10 in the retina using a novel multifunctional BAC transgenic mouse reporter.</a> Dev Biol. 271 (2), 388-402 (2004).</li>
<li>Andilla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tissue-mimic+with+light+sheet+microscopy%3A+A+comparative+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging tissue-mimic with light sheet microscopy: A comparative guideline.</a> Sci Rep. 7, 44939(2017).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Opt+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Adv Opt Photonics. 10, 111(2018).</li>
<li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li>
<li>Darche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+of+cleared+human+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy of cleared human eyes.</a> Commun Biol. 6 (1), 1025(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10 objetivos NA0.40 DRY</td><td>Leica</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>63x Objetivo NA1.40 OIL</td><td>Leica</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>AB13970</td><td>-</td></tr><tr><td>Alcohol bencílico (BA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13162</td><td>-</td></tr><tr><td>Benzoato de bencilo (BB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W213802</td><td>-</td></tr><tr><td>placa de Petri de vidrio inferior</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>-</td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticuerpo Chx10</td><td>Sta Cruz Biotech</td><td>SC-365519</td><td>-</td></tr><tr><td>Columnas de filtración en gel Cytiva Illustra Nap-5, Sephadex G-25</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17-0853-02</td><td>-</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>-</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>-</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Termopescador</td><td>62251</td><td>-</td></tr><tr><td>Colorante (ácido carboxílico, éster de succinimida)</td><td>Invitrogen o Abberior</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>ImagenJ/Fiji&nbsp;</td><td>NIH</td><td>&nbsp; v1.50i</td><td>-</td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal invertido</td><td>Microsistemas Leica</td><td>TCS SP8 STED 3X-FALCON</td><td>-</td></tr><tr><td>Software de procesamiento 3D LAS X</td><td>Microsistemas Leica</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>mQ H2O</td><td>-</td><td>-</td><td>Agua ultrapura del sistema de purificación de agua Synergy</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Acros Organics</td><td>424270010</td><td>-</td></tr><tr><td>IgG secundaria no marcada</td><td>Inmunoinvestigación de Jackson</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticuerpo azul opsina</td><td>Millipore&nbsp; &nbsp;</td><td>AB5407&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticuerpo Opsina RG</td><td>Millipore</td><td>AB5745&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA) 4%</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>J199943-K2</td><td>-</td></tr><tr><td>Solución PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>-</td></tr><tr><td>Sondas de marcaje de faloidina</td><td>Termopescador</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10010023</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticuerpo RECOV</td><td>Millipore</td><td>AB5585-I&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticuerpo RHO (RET-P1)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O4886&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Citrato de sodio tribásico dihidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>-</td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticuerpo TUJ1</td><td>Covance&nbsp;</td><td>MMS-435P&nbsp;</td><td>-</td></tr></tbody></table>

visualización de organoides retinianos de montaje completo con resolución celular

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

Visualización de organoides retinianos de montaje completo con resolución celular

Retinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells are intricate 3D structures that mimic the human retina, offering a powerful platform ...

whole-mount-retinal-organoid-visualization-with-cellular-resolution

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este artículo video demuestra el establecimiento de cultivos de retina organotípicos wholemount y un procedimiento citospina para el análisis de los efectos inducidos exógenamente. Organotípicos culturas wholemount imitar la...

En vivo-como organotípicos Cultura murino wholemount retina

Toda la estructura 3D y el contenido celular de los organoides, así como su parecido fenotípico con el tejido original se pueden capturar utilizando el protocolo de imágenes 3D de resolución de una sola célula descrito aquí. Este protocolo se puede aplicar a una amplia gama de organoides que varían en origen, tamaño y forma.

Imagen tridimensional de resolución de una sola célula de organoides intactos

Aquí se presenta una técnica quirúrgica para trasplantar tejido retiniano derivado de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en el espacio subretiniano de un modelo animal grande.

Trasplante subretiniano de tejido retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo felino de animales grandes

Este estudio tiene como objetivo desarrollar un nuevo modelo de cultivo de retina organotípico humano (HORC) que evite comprometer la integridad de la retina durante el manejo del explante. Esto se logra cultivando la retina con el vítreo resbanante y el epitelio-coroides pigmentario retiniano subyacente (RPE-coroides) y esclerótica.

Caracterización de una nueva técnica de cultivo de retina organotípica humana

Utilizando un método de autoorganización, desarrollamos un protocolo con la adición de COCO que podría aumentar significativamente la generación de fotorreceptores.

Inducción dirigida de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes humanas

Aquí describimos un sistema optimizado de inducción organoide retiniana, que es adecuado para varias líneas de células madre pluripotentes humanas para generar tejidos retinianas con alta reproducibilidad y eficiencia.

Sistema de inducción organoide retiniana para la derivación de tejidos retinianas 3D a partir de células madre pluripotentes humanas

Este protocolo describe un método eficiente para diferenciar las hiPSC en grupos de campo ocular y generar organoides neurorretinianos utilizando condiciones de cultivo simplificadas que involucran sistemas de cultivo adherentes y en suspensión. Otros tipos de células oculares, como el EPR y el epitelio corneal, también se pueden aislar de campos oculares maduros en cultivos de retina.

Generación de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes sanas y específicas de la enfermedad retiniana inducida por humanos

Este protocolo proporciona un procedimiento de preparación optimizado y elaborado para muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión. Es adecuado para aplicaciones que involucran el análisis de sinapsis en organoides retinianos maduros.

Preparación de muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión

La microglía es una célula inmunitaria residente única en la retina que desempeña un papel crucial en diversas enfermedades degenerativas de la retina. La generación de un modelo de cocultivo de organoides retinianos con microglía puede facilitar una mejor comprensión de la patogénesis y el progreso del desarrollo de las enfermedades de la retina.

Ensamblaje de organoides de la retina con microglía

La retina exhibe una organización espacial compleja a través de su estructura laminar. La transcriptómica espacial moderna y las técnicas de secuenciación requieren secciones de tejido &lt; 20 μm de grosor, lo que limita su aplicabilidad en la investigación de la retina. Este método de criosección recién congelada produce secciones delgadas en la cara de la retina del ratón al tiempo que preserva las relaciones espaciales planas, lo que permite un mapeo molecular completo a través de las...

En la cara Crioseccionamiento de retina de ratón para análisis molecular espacial de alta dimensión

Aprende a visualizar organoides retinianos completos mediante aclarado óptico e inmunomarcado con microscopía confocal. Este método revela la organización celular tridimensional y conexiones neuronales para estudiar enfermedades retinianas.

Visualización de organoides retinianos de montaje completo con resolución celular

Explorar más videos