Visualización de organoides retinianos de montaje completo con resolución celular

Nuestro trabajo se centra en desarrollar y estudiar organoides retinianos que sirven como modelo humano in vitro para estudiar cómo se forma la retina humana, cómo afectan las enfermedades y cómo podríamos tratarlas.

Para avanzar en la investigación en el campo de la medicina regenerativa, utilizamos organoides de retina 3D combinados con limpieza óptica y etiquetado inmunológico para visualizar estructuras completas y estudiar la organización especial de las células de la retina con microscopía confocal.

Las imágenes de montaje completo enfrentan desafíos, como la penetración desigual de anticuerpos en tejidos densos y la aberración esférica en organoides, que causan etiquetado de sesgo superficial y pérdida de enfoque durante la visualización del tejido.

Nuestro método revela las conexiones celulares de la retina, los tipos de células, bajo organización 3D, proporcionando información crucial sobre las causas subyacentes de las enfermedades de la retina.

[Instructor] Para comenzar, obtenga las alícuotas de fluoróforo disueltas en DMSO anhidro, deshidratadas y congeladas. Agregue de 1 a 10 microlitros de DMSO a una alícuota. Ahora, combine 50 microlitros de inmunoglobulina G secundaria o anticuerpo primario, seis microlitros de bicarbonato de sodio molar y de uno a cinco microlitros de fluoróforo, e incube en una plataforma oscilante durante 40 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Mientras avanza la reacción, retire las tapas de las columnas de exclusión de tamaño de purificación y deje pasar el tampón. Equilibre la columna pasando tres rondas de dos a tres mililitros de PBS a través de la columna. Si el último equilibrio termina antes de que termine la incubación, vuelva a colocar las tapas para evitar que se dibujen y espere a que termine la reacción. Después de la incubación, agregue 140 microlitros de PBS a la reacción de etiquetado para llevar el volumen a aproximadamente 200 microlitros y vórtice. Agregue la solución al centro de la columna y déjela entrar en la columna. Después de que la última gota haya eludido, empuje la solución con 550 microlitros de PBS. Cuando el líquido deje de caer, eluya con 300 microlitros de PBS y recoja en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Mida la absorbancia de la muestra a 280 nanómetros y en las longitudes de onda específicas del fluoróforo para calcular la concentración de anticuerpos y las proporciones de etiquetado. Almacene los anticuerpos marcados a cuatro grados Celsius, protegidos de la luz, hasta por seis meses. Fije los organoides de la retina con aldehído paraformo al 4% a temperatura ambiente durante 45 minutos. Después de la fijación, agregue una solución de recuperación de antígenos sobre los organoides e incube el plato a 60 grados centígrados, agitando suavemente a 30 revoluciones por minuto durante una hora. A continuación, permeabilice los organoides con PBS que contenga un 1% de Triton X-100. Incube la mezcla a temperatura ambiente, agitando suavemente durante cuatro horas. Ahora, bloquee los organoides en BSA al 2% con Triton X-100 al 0,1% a temperatura ambiente durante la noche o durante más de un día. Al día siguiente, agregue anticuerpos primarios diluidos a los organoides. Incubar a cuatro grados centígrados durante dos días con agitación suave. Lave los organoides tres veces durante 15 minutos cada uno en una solución de lavado a temperatura ambiente con agitación suave. Ahora, agregue la solución de dilución de anticuerpos secundarios e incube a cuatro grados centígrados durante dos días con agitación suave. Después de lavar los organoides como se demostró anteriormente, incube los organoides con colorantes fluorescentes diluidos en una solución de lavado a temperatura ambiente durante una hora con agitación suave. Luego, lávese de nuevo. A continuación, prepare soluciones de 1-propanol en agua ultrapura a concentraciones del 15%, 30%, 45%, 60%, 75% y 90%, y ajuste cada una a pH 9,5 con trimetilamina. Deshidrate las muestras secuencialmente en gradientes crecientes de soluciones de 1-propanol durante dos horas cada una a 30 grados Celsius con agitación suave. Luego, transfiera la muestra a una solución 100% de 1-propanol e incube durante la noche a 30 grados Celsius con agitación suave. Para la limpieza de muestras, prepare una mezcla de alcohol bencílico y benzoato de bencilo en una proporción de uno a dos para hacer una solución BABB. Sumerja las muestras en BABB a temperatura ambiente durante la noche. Actualice la solución BABB antes de la creación de imágenes. Con una pipeta de vidrio, coloque el organoide en una placa de Petri con fondo de vidrio con una gota de BABB, asegurándose de que entre en contacto con la superficie del cubreobjetos. Ahora, utilice un microscopio de escaneo láser confocal invertido con objetivos de bajo y alto aumento para adquirir imágenes de pila Z para una resolución celular 3D. Recalibre el tamaño del paso de la adquisición de la pila Z teniendo en cuenta el desajuste del índice de refracción entre la solución de aclarado y los medios de inmersión. Ahora, inicie ImageJ, actualice la profundidad del vóxel seleccionando Imagen y haciendo clic en Propiedades para crear proyecciones de imágenes de la pila Z. Inspeccione la profundidad de la pila Z seleccionando Imagen, luego Pilas y eligiendo Vistas ortogonales para mostrar las vistas XY, XZ e YZ del organoide retiniano. Guarde las regiones deseadas haciendo clic en Archivo y seleccionando Guardar como. Por último, cree una animación del renderizado 3D de la pila Z utilizando un software de procesamiento. Los organoides de la retina eliminados con glicerol de fructosa mostraron la menor mejora en la transparencia, lo que dificulta la visualización del núcleo del organoide. La limpieza de ECI mejoró la visualización de las capas de la retina, pero aún no pudo revelar el núcleo del organoide debido a la dispersión persistente de la luz. Los organoides aclarados con Fluoclear BABB exhibieron la mayor transparencia, revelando claramente tanto la corteza como el núcleo con fluorescencia consistente. Tanto los organoides aclarados ECI como los fluoclear BABB exhibieron una contracción visible en las imágenes de campo claro debido a los pasos de deshidratación. La contracción inducida por BABB aumentó la compacidad de la muestra, lo que permitió el uso de objetivos de gran aumento para obtener imágenes de estructuras más profundas. El inmunomarcaje de TUJ1 a los 40 días in vitro mostró una sola capa neuronal delgada sin estratificación visible. A los 90 días, las células poblaron densamente la región apical, y a los 170 días, el organoide mostró claros signos de organización en capas con una zona apical definida. A los 200 días, las proyecciones celulares alargadas se extendieron hacia adentro desde la superficie hasta el núcleo, y el organoide se desarrolló en tres capas retinianas distintas a los 250 días. Las fibras neuronales se extendieron desde el centro del organoide hacia la periferia a lo largo de la maduración, volviéndose más gruesas y complejas a los 250 días in vitro. Los fotorreceptores de cono que expresan opsinas azules y verdes/rojas aparecieron en etapas tardías y mostraron morfologías alargadas con puntas brillantes. Los fotorreceptores de bastones que expresan rodopsina se identificaron por sus núcleos centrales y distribución periférica de opsina. Las células positivas para Chx10 se distribuyeron inicialmente ampliamente, pero luego se localizaron específicamente en la capa nuclear interna durante la maduración de los organoides. La expresión endógena de GCaMP6s se conservó después de la eliminación de BABB, con una señal de GFP detectable en la retina neural después de la fijación a largo plazo.