Microscopía electrónica de transmisión como técnica de visualización para el análisis de la plasticidad sináptica circadiana en la corteza del barril del ratón

Estamos interesados en la plasticidad neuronal, particularmente en los cambios circadianos en la plasticidad de las sinapsis, las neuronas y las células gliales. Estamos tratando de responder a la pregunta de cómo se transforman las sinapsis durante el día y la noche y en condiciones patológicas. Los desarrollos más recientes en nuestro campo de estudios es el uso de diversas herramientas genéticas para manipular con la expresión génica, utilizando también métodos para visualizar cambios en el cerebro, así como hay un número creciente de modelos animales para estudiar enfermedades neurodegenerativas. Hemos encontrado, utilizando un microscopio de transmisión electrónica, que el número de sinapsis en la corteza del barril de los ratones cambia durante el día y la noche. Y este ritmo también es circadiano, al menos en el caso de las sinapsis inhibitorias. Debido a las sinapsis inhibitorias, aumentan en número durante la noche, mientras que las sinapsis excitatorias aumentan durante el día. Cambios similares hemos encontrado en el cerebro de la mosca de la fruta. En esta especie, también el número de sinapsis cambia durante el día y la noche. Y además, hemos encontrado cambios estructurales en la forma de las neuronas y las células gliales.

[Narrador] Para comenzar, tome el cerebelo del ratón y divida el cerebro en dos hemisferios. Elija un hemisferio y oriéntelo de modo que las secciones se puedan cortar tangencialmente a la corteza del barril. Luego, corte las secciones con un espesor de 60 micrómetros y transfiéralas a una solución que contenga tampón de fosfato de 0,1 molares y fijador en una proporción de uno a cinco. Examine las secciones bajo un microscopio óptico y recoja solo aquellas secciones que muestren claramente la corteza del campo de barril. Con un pincel, transfiera suavemente las secciones a una pequeña placa de Petri de vidrio. Enjuague las secciones del cerebro con cacodilato de 0,1 molares. Luego, fije las secciones en tetróxido de osmio al 1% en tampón de cacodilato 0.1-molar con ferricianuro de potasio al 1.5%. Una vez que las secciones se enjuagan con agua destilada, use una jeringa con un filtro de 25 milímetros para dispensar lentamente etanol al 70% que contiene acetato de uranilo al 1% en cada placa de Petri con pañuelos. Después de la incubación nocturna en etanol al 70% a cuatro grados centígrados, lave los tejidos en etanol al 80%, 90% y 100%. Luego, lave los pañuelos dos veces en óxido de propileno durante 10 minutos cada uno. A continuación, reemplace el óxido de propileno con dos mililitros de una mezcla uno a uno de resina Poly / Bed y óxido de propileno. Cubra con una tapa e incube durante 40 minutos. Incruste las secciones del cerebro en dos mililitros de una mezcla de tres a uno de resina Poly / Bed y óxido de propileno. Cubra y deje reposar durante 1,5 horas. Luego, corte la película ACLAR en pedazos que coincidan con el tamaño de un portaobjetos de vidrio estándar. Con una pipeta de plástico, aplique un pequeño volumen de resina sobre cada pieza de película ACLAR. Con un pincel, transfiera las secciones del cerebro de la placa de Petri a la resina de la película ACLAR. Incruste cada sección entre dos películas ACLAR e incube para polimerizar. Usando un microscopio óptico con un objetivo de dos tiempos, fotografíe las secciones cerebrales incrustadas. Para abrir las imágenes, haga clic en Archivo y abrir, seleccione las imágenes mientras mantiene presionada la tecla Mayús y haga clic en Abrir. Comience a apilar imágenes de la corteza. Haga clic con el botón derecho en la Capa 1 de cada imagen, seleccione Duplicar capa e introduzca el número de imagen como nombre en el cuadro de diálogo. Elija una imagen como archivo de destino y haga clic en Aceptar. A continuación, use la herramienta Mover para alinear las imágenes manualmente y ajuste la orientación con Editar, Transformar, Rotar o Voltear según sea necesario. Para realizar ajustes más precisos, utilice Editar, Transformar, Distorsionar y mueva las esquinas individualmente para que coincidan con los puntos de referencia anatómicos. Establezca el modo de fusión de la capa superior para superponerla en el panel Capas para facilitar la alineación. En cada sección que muestra la corteza del barril, use un microscopio estereoscópico para identificar el barril seleccionado y córtelo junto con el adyacente con una cuchilla de afeitar. Después de incrustar la sección en el bloque de resina, recoja las secciones ultrafinas en rejillas de níquel de una sola ranura recubiertas de Formvar. Después de alinear la pila de imágenes TEM como se demostró anteriormente, defina el área de análisis. Haga clic en Capa seguido de Nuevo y Capa, luego haga clic en Aceptar. Seleccione la herramienta Rectángulo, vaya a Capa, Estilo de capa, Trazo. Establece el color, el grosor y la posición del trazo en el interior y, a continuación, haz clic en Aceptar. Ahora, dibuje un rectángulo para definir el límite de análisis y seleccione Relleno 0%. Para agregar una nueva capa para anotaciones, seleccione Capa, Nueva, Capa y, a continuación, haga clic en Aceptar. Utilice la herramienta Pincel para marcar sinapsis en esta capa. Utilice la herramienta Zoom y la herramienta Mano para garantizar la precisión al anotar. Ahora, abra la pila de imágenes destinada a la reconstrucción 3D. Seleccione la herramienta Recortar, marque la región que contiene la columna dendrítica en la pila y pulse Intro para recortar esa región en todas las capas visibles. Para que solo una capa sea visible a la vez, active el icono del ojo en el panel Capas. Haga clic en Archivo, Guardar como, asigne un nombre al archivo, seleccione el formato JPG y haga clic en Aceptar para guardar cada imagen recortada por separado. Abra el software de reconstrucción 3D. Antes de cargar, haga clic en Z en el gizmo de navegación o presione el teclado numérico 7 para alinear la perspectiva de la ventana gráfica. A continuación, para cargar las imágenes, haga clic en Agregar, Imagen, Referencia, luego seleccione la primera imagen y haga doble clic para confirmar. Para colocar la imagen TEM final a lo largo del eje z, haga clic en la imagen. En el panel Propiedades del objeto de la barra lateral derecha, introduzca el valor adecuado en el campo Ubicación Z. Para distribuir todas las imágenes uniformemente a lo largo del eje z, seleccione todos los objetos de imagen. Pulse Fin para abrir el panel Fin. Vaya a la pestaña Editar y haga clic en Distribuir Z para espaciarlos automáticamente en función del grosor de la sección. Para delinear manualmente la forma de la columna dendrítica en cada imagen TEM utilizando una sola curva por imagen, haga clic en Agregar, Curva y Círculo. Para mover el círculo, mantenga presionada la tecla g, arrastre el mouse y luego haga clic para confirmar la ubicación. Mantén pulsada la tecla s para ajustar el tamaño y, a continuación, haz clic para confirmar. A continuación, escale el objeto para alinearlo con la forma de la columna dendrítica. Ahora, modifique la forma curva para que se ajuste al límite del lomo. Seleccione un punto de control, presione g, mueva el punto y haga clic para confirmar. Usa las teclas g o s según sea necesario para ajustar los puntos del mango, refinando la dirección y la intensidad de la curva. Para agregar más detalles, mantenga presionada la tecla Mayús y seleccione dos puntos de control vecinos. A continuación, haga clic con el botón derecho y elija Subdividir para insertar un nuevo punto entre ellos. Una vez que la curva delinee con precisión el lomo, ingrese a la pestaña Diseño, haga clic con el botón derecho en el objeto de círculo Bézier y elija Duplicar objeto sin mover el mouse. Para conectar las aristas del objeto unido y formar una malla cerrada, ingrese a la pestaña Modelado. Presione 2 para cambiar al modo de selección de borde. Haga clic en Seleccionar, Todo, haga clic con el botón derecho y elija Bridge Edge Loops para vincular los anillos de borde. Para rellenar el espacio en la parte superior del objeto, anule la selección de todo haciendo clic junto a él. Mantén presionada la tecla Alt y haz clic en un borde de la repisa superior para seleccionar todo el bucle. Haga clic con el botón derecho y elija Extruir bordes, arrastre hacia arriba a lo largo del eje z. Ahora, presione s, mueva el mouse hacia adentro para reducir el nuevo bucle y haga clic para confirmar. Con el bucle aún seleccionado, haga clic con el botón derecho y elija Nueva cara de Aristas. Para suavizar la estructura final, ve a la pestaña Modificadores en la barra lateral derecha. Haga clic en Agregar modificador, vaya a Generar y seleccione Superficie de subdivisión. Establezca la ventana gráfica y los niveles de renderizado en uno para un suavizado uniforme. Para asignar color a estructuras individuales, seleccione el objeto deseado. Abra la pestaña Material en la barra lateral derecha, haga clic en Nuevo y establezca el color base. Seleccione el objeto de luz para ajustar la iluminación de la escena. Mantenga presionada la posición g, mueva el mouse para cambiar la posición de la luz y haga clic para confirmar su nueva ubicación. Para colocar la cámara para el renderizado, oriente la ventana gráfica para que mire hacia el lomo dendrítico como debería aparecer en el resultado final. Presione Control + Alt + teclado numérico 0 para ajustar la cámara a la vista actual. Ajuste el marco de la cámara seleccionándolo, manteniendo presionada la tecla g y moviéndolo para refinar el encuadre. La corteza somatosensorial del ratón fue identificable incluso en secciones cerebrales no teñidas, y todo el campo de barriles pudo reconstruirse utilizando herramientas digitales a pesar de la distribución de barriles individuales en múltiples secciones. Las imágenes TEM ultrafinas consecutivas permitieron la clasificación confiable de las sinapsis en tipos excitatorios o inhibidores en función de la evidencia visual en serie. La reconstrucción tridimensional de las espinas dendríticas a partir de secciones seriadas permitió la visualización de la morfología de la columna vertebral, revelando diferentes formas, como espinas delgadas, en forma de hongo, rechonchas e intermedias. Las formas de la columna vertebral se cuantificaron en función de las medidas, incluida la longitud de la columna vertebral, la longitud del cuello y los diámetros de la columna vertebral, la cabeza y el cuello.