Producción de un sistema de partículas similar al virus SARS-CoV-2 para investigar los ciclos de vida virales in vitro

Presentamos un protocolo in vitro optimizado para producir partículas similares al virus SARS-CoV-2 que imitan de cerca al virus auténtico. Este enfoque permite la investigación de los mecanismos de infección, ensamblaje y salida virales sin las limitaciones de requerir un laboratorio de nivel de bioseguridad 3.

Nuestra investigación se centra en comprender la biología del virus SARS-CoV-2 y tratar de encontrar medicamentos, particularmente de la medicina china contra el SARS-CoV-2. Todo el estudio del virus vivo del SARS-CoV-2 debe controlarse en un laboratorio de nivel tres de bioseguridad. Y esta limitación experimental hace que un estudio del SARS-CoV-2 solo sea factible en un puñado de vidas. El virus SARS-CoV-2 como método práctico del estudio sobre el SARS-CoV-2 es posible sin limitación de laboratorio de nivel tres de bioseguridad, y la lista será un método muy útil.

[Instructor] Para comenzar, siembre aproximadamente 3 millones de células HEK-293T en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros de diámetro con medio completo DMEM, suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Cultive las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24 horas. Verifique la cofluencia celular bajo el microscopio. Diluya 60 microlitros de PEI de una solución madre de un miligramo por mililitro con medio sin suero para alcanzar un volumen final de 200 microlitros. Ahora, tome 200 microlitros de medio sin suero y agregue 6,7 microgramos de plásmido N, 10 microgramos de plásmido Luc-T20, 0,016 microgramos de plásmido S y 3,3 microgramos de plásmido M-IRES-E. Agregue suavemente la solución de PEI diluida en la solución que contiene plásmidos que recubren las proteínas de estructura viral e incube la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Esta es la solución de transfección. Deje caer con cuidado la solución de transfección sobre las células HEK-293T y agite suavemente la placa de cultivo de tejidos para asegurar una mezcla completa. Intercambie el medio de cultivo celular con el medio completo de DMEM seis horas después de la infección e incube las células HEK-293T transfectadas a 37 grados Celsius con dióxido de carbono al 5% durante 48 horas. Recolecte el sobrenadante de las células HEK-293T infectadas, que contienen partículas similares al virus SARS-CoV-2. Filtre el sobrenadante recolectado a través de un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros para eliminar los desechos celulares. Este es el medio SC2-VLP. Siembre 40,000 células HEK-293T con expresión estable de la enzima convertidora de angiotensina 2, o ACE2, y TMPRSS2 en una placa de 96 pocillos y agregue 50 microlitros de medio SC2-VLP. Incube la placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Después de la incubación, retire el medio de cada pocillo de la placa de 96 pocillos y lave una vez con 100 microlitros de PBS precalentados a 37 grados centígrados. Lisar las células HEK-293T sembradas con células TMPRSS2 ACE2 con 20 microlitros de tampón de lisis pasiva y agitar suavemente la muestra en un agitador orbital durante 15 minutos a temperatura ambiente. Gire la placa de 96 pocillos a 4.000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados con una centrífuga de microplacas refrigerada y luego transfiera inmediatamente la placa a un baño de hielo. Tome 100 microlitros de tampón de ensayo de luciferasa reconstituida en una nueva placa blanca opaca de 96 pocillos y agregue 20 microlitros de lisado en cada pocillo. Mezcle brevemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces. Mida la señal de luminiscencia con un lector de placas. A continuación, para evaluar la composición del medio SC2-VLP, agregue 1,36 mililitros de solución PEG 8000 a 10 mililitros de medio SC2-VLP. Coloque la mezcla en una coctelera orbital y mezcle lentamente a cuatro grados centígrados durante la noche. Centrifugar la solución a cuatro grados centígrados y 2.000 G durante 30 minutos. Y recoja el gránulo SC2-VLP para el análisis de Western blotting. Siembre aproximadamente 3 millones de células HEK-293T de manera uniforme en una placa de cultivo con fondo de vidrio con un diámetro de 15 milímetros y permita que las células se adhieran y crezcan hasta que alcancen aproximadamente el 70% de confluencia. Después de seccionar las células como se demostró anteriormente con las cantidades de plásmidos modificadas, lave suavemente la placa de cultivo dos veces con un mililitro de PBS helado. Agregue un mililitro de solución de fijación de aldehído paraformo al 4% a temperatura ambiente e incube durante 15 minutos. Lave las células dos veces durante cinco minutos cada una con un mililitro de PBS a temperatura ambiente y permeabilice las células agregando un mililitro de Triton X-100 al 0,25% durante 10 minutos. Nuevamente, lave las células dos veces durante cinco minutos cada una con un mililitro de PBS a temperatura ambiente. Luego agregue un mililitro de albúmina sérica bovina al 5% durante una hora para bloquear las interacciones de anticuerpos no específicas. Agregue aproximadamente 200 microlitros de solución de anticuerpos primarios para cubrir el fondo de vidrio e incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Luego, retire la solución de anticuerpos primarios y lave las células tres veces durante cinco minutos cada una con un mililitro de PBS a temperatura ambiente. Ahora, agregue una solución de anticuerpo secundario conjugada con fluorescencia e incube a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavar las células tres veces con PBS, tiña los núcleos con 2,5 microgramos por mililitro de solución de Hoechst a temperatura ambiente durante cinco minutos. Finalmente, después de lavar las células con PBS, observe la tinción de la proteína S o del orgánulo antes de adquirir imágenes con un microscopio confocal. Esta figura ilustra la sensibilidad de la producción de SC2-VLP a cantidades variables de transfección del plásmido que codifica la proteína de pico. El título de SC2-VLP fue más alto cuando se transfectaron 0,016 microgramos de plásmido S y disminuyó significativamente con 0,16 y 1,6 microgramos de plásmido s. La mutación H1271 a E en la proteína de pico redujo significativamente el título de SC2-VLP en comparación con el tipo salvaje. La mutación E1262 a H condujo a una reducción moderada en el título de SC2-VLP, mientras que la doble mutación E1262 a H, H1271 a E abolió la producción por completo. Las bandas de proteínas S y S-2 de longitud completa se redujeron en los carriles E1262 a H y doble mutante, en comparación con el tipo salvaje. La eficiencia del empaquetado S también se redujo en los mutantes E1262 a H y H1271 a E y casi se abolió en el doble mutante. La abundancia de VLP se mantuvo prácticamente sin cambios en los mutantes de tipo salvaje y en todos los mutantes S. Proteína S de tipo salvaje colocalizada con el marcador cis-Golgi GM130, pero no con el marcador ER Sec61 beta o el marcador ERGIC ERGIC 53. La proteína S mutante H1271 a E mostró una distribución citoplasmática difusa y carecía de colocalización con GM130.