Una guía paso a paso para el aislamiento y análisis de la superficie foliar y el ARN apoplásico utilizando rosetas de Arabidopsis

Estamos tratando de comprender cómo las plantas regulan sus microbiomas y si los ARN secretados por las plantas regulan la expresión génica en microbios procariotas y eucariotas que colonizan las plantas. Utilizamos una combinación de electroforesis de concha de alta resolución y análisis basado en Illumina para evaluar los ARN presentes en la superficie de la hoja y cómo cambian en respuesta al estrés biótico. Si bien estudios recientes sugieren que los ARN extracelulares son absorbidos por patógenos fúngicos y bacterianos, los mecanismos subyacentes de la absorción de ARN y las consecuencias funcionales de esta absorción permanecen en gran medida inexplorados.

Para comenzar, tome plantas de arabidopsis de seis a siete semanas para cada réplica. Agregue silhouette L-77 al VIB estéril, antes de comenzar el aislamiento del lavado de la superficie de la hoja. Luego, usando un cilindro de medición, transfiera 100 mililitros de la solución VIB preparada a una botella rociadora de 500 mililitros.

Con unas tijeras finas, separe con cuidado las rosetas de arabidopsis de sus raíces. Después de eso, use un cepillo suave para eliminar el exceso de tierra de los pétalos. Coloque las rosetas separadas en una bandeja plana con la superficie abaxial hacia arriba.

A continuación, rocíe la superficie abaxial con cinco bombas de la botella de spray llena de VIB y agente humectante. Voltee con cuidado las rosetas y rocíe la superficie adaxial. Prepare jeringas modificadas con agujeros en la parte inferior envolviéndolas con película para alrededor del cuello para suspender la punta por encima del fondo de la botella.

Para recuperar el lavado de la superficie de la hoja, inserte suavemente las rosetas rociadas en las jeringas modificadas de 60 mililitros sin aguja colocadas dentro de botellas centrífugas de 250 mililitros y rocíe dos bombas firmes de tampón en la jeringa. A continuación, centrifugar los frascos cargados a 100 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Ahora filtre la superficie de la hoja recuperada, lave a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros y recoja el filtrado en un tubo de centrífuga de 50 mililitros, mantenido en hielo.

Para el método de hisopo de la superficie de la hoja, rocíe las rosetas separadas con la solución de VIB y agente humectante de la misma manera que se describe en el paso anterior. Para recuperar el hisopo de la superficie de la hoja, use palitos de punta de algodón estériles para frotar las superficies adaxial y abaxial de las rosetas. Luego presione las puntas empapadas contra la pared interna de un tubo de centrífuga de 15 mililitros para extraer el líquido.

Filtre la muestra de hisopo de la superficie de la hoja extraída, a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros en un tubo de dos mililitros colocado sobre hielo. Coloque el mismo conjunto de plantas utilizadas anteriormente para el lavado de la superficie de las hojas o el aislamiento del hisopo en un vaso de precipitados limpio y enjuáguelas suavemente dos veces con agua destilada. Para infiltrar al vacío las rosetas con VIB, coloque con cuidado las rosetas enjuagadas en una cafetera de prensa francesa que contenga de 300 a 500 mililitros de VIB.

Asegure la tapa y baje suavemente el émbolo hasta que las rosetas estén completamente sumergidas. Inserte la prensa francesa en una cámara de vacío y aplique un vacío durante 20 segundos con una bomba de vacío hasta que las plantas estén bien infiltradas. Después de soltar la aspiradora, retire la prensa francesa de la cámara y retire la tapa.

Vierta el VIB en un vaso de precipitados de plástico de 500 mililitros y retire las rosetas. Luego agite suavemente las rosetas y cepille las hojas sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de tampón. Ahora, con papel secante, seque suavemente las superficies de las hojas para eliminar cualquier tampón restante.

Para recoger el líquido de lavado aplástico, inserte las rosetas infiltradas VIB en jeringas sin aguja de 60 mililitros, colocadas dentro de botellas de centrífuga de 250 mililitros como se hizo anteriormente. Centrifugar las botellas a 600 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados con aceleración lenta. Luego filtre el líquido de lavado aplástico acumulado a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros en un tubo de 15 mililitros colocado sobre hielo.

Prepare o compre un mini gel que contenga poliacrilamida al 10 o 15% y siete molares de urea en tampón EDTA de ácido trisbórico, utilizando una solución de acrilamida y bis. Luego mezcle las muestras de ARN con tampón de carga desnaturalizante dos veces. Calienta la mezcla a 65 grados centígrados durante cinco minutos e inmediatamente colócala sobre hielo.

Ahora resuelva las muestras de ARN en 0,5 veces TBE funcionando tampón a temperatura ambiente aplicando 220 voltios durante aproximadamente una hora y 15 minutos. A continuación, tiñe el gel con gel de ácido nucleico cyber gold en 0,5 veces TBE durante 10 minutos. Enjuague el gel dos veces con agua destilada y obtenga una imagen, utilizando un sistema de imágenes.

Para cuantificar las bandas de ARN resueltas, utilice el método de análisis de gel de la documentación de la Imagen J en el menú de análisis y análisis de gel. Prepare estándares de ARN para dos réplicas técnicas diluyendo el ARN de lisado celular en agua libre de ARNasa y ADNasa. Para preparar una tinción de gel de ácido nucleico de oro cibernético 1,5 veces, disuélvala en tampón tris HCL de 500 milimolares a pH ocho.

Para la configuración de la microplaca, agregue 99 microlitros de agua destilada a cada pozo. A continuación, agregue un microlitro de ARN a cada pocillo usando el mismo volumen tanto para las muestras de ARN como para los estándares. Finalmente, agregue 50 microlitros de solución de oro cibernético a cada pozo.

Para configurar los parámetros del lector de microplacas, elija agitación lineal u orbital durante tres segundos. Configure el lector de microplacas en modo de punto final de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 496 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 540 nanómetros. Construya una línea de calibración, utilizando los valores de intensidad de fluorescencia de los patrones de ARN.

El análisis de gel de ARN desnaturalizante reveló que tanto las muestras de líquido de lavado de la superficie de la hoja como las de líquido de lavado aplásico contienen una amplia gama de tamaños de ARN, incluidas especies de ARN largas y pequeñas. Las cantidades totales de ARN aisladas del líquido de lavado aplásico y el lavado de la superficie de la hoja fueron similares, cuando se normalizaron al peso fresco de la planta. Los perfiles de ARN del lavado de la superficie de la hoja, el lavado aplásico y el lisado celular difieren notablemente, lo que confirma una contaminación mínima del ARN intracelular y muestra que el ARN aplásico está altamente procesado con bandas difusas de bajo peso molecular con una adición del 0,001% de silueta L-77 al tampón de aislamiento de vesículas que casi duplicó el rendimiento de ARN de las superficies de las hojas en comparación con el tampón sin el agente humectante.

Pero aumentar esta concentración al 0,01% no mejoró aún más la recuperación de ARN. Un segundo lavado de las mismas hojas recuperó aproximadamente el 63% del ARN obtenido en el primer lavado, lo que indica una secreción continua de ARN en la superficie de la hoja. La cuantificación de ARN, utilizando ensayos de placa de microtitulación basados en fluorescencia, demostró una alta linealidad con la concentración de ARN para los métodos de detección de oro cibernético y RIBO 488.

Hemos demostrado que el ARNt y los fragmentos derivados del ARNt, o TDR, son especialmente abundantes en el ARN extracelular, probablemente debido a su resistencia a la degradación. Por lo tanto, creemos que estos TDR probablemente regulan la expresión génica en las bacterias. Deseamos identificar las fuentes celulares de ARN de la superficie de la hoja y las funciones biológicas que esta ARNasa de la superficie de la hoja podría estar desempeñando en el contexto de las interacciones microbianas planificadas.