Medición de monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) en tejidos sólidos mediante un ensayo competitivo de inmunoabsorción enzimática (ELISA)

El Laboratorio Dechter investiga el metabolismo del óxido nítrico. El óxido nítrico estimula la formación cíclica de GMP a través de una cascada de homeostasis adaptativa. Nuestro objetivo es aprender cómo el envejecimiento, la dieta y otros factores afectan esta cascada. Investigaciones anteriores se centran en la formación de óxido nítrico y los efectos fisiológicos resultantes al descuidar la cascada que conecta los dos. Nuestro protocolo mide el GMP cíclico, un segundo mensajero en la cascada. Nuestro protocolo es simple, accesible y fácilmente adaptable a varios tipos de tejidos.

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Coloque un pulverizador de tejidos, pinzas y una cuchara sobre hielo seco durante 10 minutos. Pesar un exceso de tejido porcino para tener en cuenta la pérdida durante la pulverización. Transfiera el tejido al pulverizador frío colocado sobre hielo seco. Congele rápidamente el tejido vertiendo nitrógeno líquido en el pulverizador y deje que se vaporice completamente antes de continuar. Luego vuelva a colocar la tapa del pulverizador y golpéelo 15 veces con un mazo. Ahora, tara un tubo homogeneizador de perlas en una balanza. Con la cuchara fría y las pinzas, transfiera el tejido pulverizado al tubo. Pipetear ácido clorhídrico normal 0,1 en el tubo de homogeneización, asegurando que el volumen en microlitros sea un múltiplo de la masa tisular en miligramos. A continuación, homogeneice la muestra de tejido con un homogeneizador de molino de perlas. Centrifugar el homogeneizado a 17.000 g durante 30 minutos, manteniendo una temperatura de muestra de cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante resultante a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar nuevamente durante 10 minutos, manteniendo una temperatura de muestra de cuatro grados centígrados. Pipetear una alícuota del sobrenadante final en un tubo de microcentrífuga y colocarlo sobre hielo. A continuación, pipetee 9,9 mililitros de tampón ELISA en un tubo etiquetado como Estándar B. Pipetee 100 microlitros de solución madre estándar en el tubo estándar B. Agite completamente para garantizar una suspensión uniforme. Transfiera 1,000 microlitros de la solución del Estándar B al tubo etiquetado como Estándar 1. Luego agregue 500 microlitros de tampón ELISA a los tubos etiquetados como Estándar 0 y Estándares 2 a 8. Estándar de vórtice 1. Luego transfiera 500 microlitros de la solución al Estándar 2. Luego vórtice el estándar 2 y transfiera 500 microlitros de la solución al estándar 3. Continúe transfiriendo 500 microlitros de cada estándar anterior al siguiente, agitando completamente después de cada edición hasta que se prepare el estándar 8. Para la acetilación de las muestras, agregue 50 microlitros de hidróxido de potasio de cuatro molares a una alícuota de muestra de 250 microlitros. Agregue inmediatamente 12,5 microlitros de anhídrido acético. Agite la solución durante 15 segundos. Luego pipetee 12,5 microlitros de hidróxido de potasio de cuatro molares y vuelva a colocar un vórtice. Al tubo etiquetado como Estándar 0, agregue 100 microlitros de hidróxido de potasio de cuatro molares, seguidos inmediatamente de 25 microlitros de anhídrido acético. Después del vórtice, pipetee 25 microlitros de hidróxido de potasio de cuatro molares en el tubo y haga un vórtice brevemente. Repita las adiciones de hidróxido de potasio y anhídrido acético, seguidas de un vórtice para los patrones restantes, agregue una proporción predeterminada de tampón ELISA y alícuota de muestra acetilada a un tubo de microcentrífuga. Estándar de vórtice 0. Transfiera 50 alícuotas de microlitros del Estándar 0 a cinco pocillos designados como pocillos NSB y B de la microplaca ELISA. Luego agregue 50 microlitros de tampón ELISA en los dos pocillos NSB que contienen el estándar 0. Con una sola punta de pipeta, agregue 50 alícuotas de microlitros de los patrones 1 a 8 en pocillos duplicados, comenzando con el estándar 8 y continuando con el estándar 1. Vórtice cada muestra. Luego agregue 50 microlitros en los pocillos apropiados por duplicado o triplicado. Ahora, pipetee 50 microlitros de trazador de acetilcolinesterasa a todos los pocillos designados como NSB, B naught, estándar y muestra. Agregue 50 microlitros de antisuero a cada B nada, estándar y pozo de muestra. Cubra la placa ELISA e incube a cuatro grados centígrados durante 18 horas. Después de la incubación, invierta la placa ELISA sobre un contenedor de residuos para eliminar el contenido. Llene los pocillos con tampón de lavado con una botella de lavado. Agite suavemente durante cinco segundos. Luego vierta el tampón de lavado y saque el líquido restante sobre una toalla de papel. Ahora, transfiera el reactivo de Ellman a un depósito. Trabajando rápidamente, use una pipeta multicanal para agregar 200 microlitros del reactivo de Ellman a los pocillos en blanco, NSB, B naught, TA, estándar y muestra. Agregue cinco microlitros de trazador de acetilcolinesterasa al pozo TA. Luego cubra la placa ELISA con Parafilm. Colóquelo en un recipiente protegido contra la luz para incubar a temperatura ambiente con agitación durante 60 a 90 minutos. Retire el Parafilm y lea la densidad óptica a 412 nanómetros La concentración cíclica de GMP en el hígado porcino en el grupo de control fue de aproximadamente 0,0202 nanomoles por gramo de tejido. En el grupo tratado con nitrato, la concentración cíclica de GMP aumentó a aproximadamente 0,0364 nanomoles por gramo de tejido.