Desarrollo de un innovador dispositivo de iluminación basado en LED para la aplicación in vitro de terapia fotodinámica con rosa de Bengala

El objetivo de nuestra investigación es desarrollar proyectos fundamentales y traslacionales con el objetivo de caracterizar el efecto de la terapia fotodinámica en el tratamiento del cáncer sin opciones terapéuticas efectivas. Los desafíos experimentales actuales son desarrollar las tecnologías necesarias para la implementación de la terapia fotodinámica desde la aplicación in vitro hasta la clínica, incluidos nuevos fotosensibilizadores y nuevos dispositivos de iluminación. En comparación con otras técnicas, nuestro protocolo implica un dispositivo casero y de bajo costo, que permite una iluminación más generosa de una placa de 96 pocillos y la condición fisiológica dentro de una incubadora de cultivo celular.

Para comenzar, retire las células HepG2 cultivadas de la incubadora y coloque el matraz debajo de la estación de seguridad microbiológica previamente limpiada. Con una pipeta, retire el medio de cultivo del matraz de cultivo. Para eliminar el medio residual, enjuague con una solución tamponada con fosfato mientras mezcla suavemente, luego retire con cuidado el tampón.

Luego, aplique tres mililitros de solución de tripsina que contenga tripsina al 0,25% y EDTA 0,53 milimolar a las células y vuelva a colocar el cultivo en la incubadora a 37 grados centígrados durante cinco minutos para separar las células. Después de cinco minutos, agregue siete mililitros de medio de cultivo al matraz para neutralizar la tripsina y suspender las células. Ahora, transfiera la tripsina, el medio y las células separadas a un tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Para contar las células, pipetee 20 microlitros de la solución celular en un tubo limpio y agregue 20 microlitros de solución azul de tripano. Después de mezclar, cargue la mezcla teñida en el portaobjetos de recuento e insértela en el contador de células. A continuación, agregue medio de cultivo a un tubo, luego introduzca las células para alcanzar una concentración final de 150, 000 células por mililitro.

Siembre 1.5 veces 10 a la potencia de cuatro células por pocillo en una placa blanca de 96 pocillos con un fondo transparente y plano. Prepare dos platos para cada tiempo de lectura de viabilidad. Incube las placas durante 24 horas antes del tratamiento para permitir que las células se adhieran.

Para preparar una solución madre de rosa de bengala, disuélvala en una solución salina al 10%. Diluya las soluciones de tratamiento de bengala rosa en concentraciones que oscilan entre cero y 100 micromolares en medio de cultivo celular. Ahora, retire el medio de cultivo de las placas celulares y agregue 100 microlitros de las soluciones de tratamiento de bengala rosa preparadas a cada pocillo.

Incube las células con bengala rosa durante dos horas para permitir la internalización. Después de dos horas, retire la solución de bengala rosa de cada pocillo, lave las células dos veces con PBS, aspire el PBS y agregue 100 microlitros por pocillo de medio de cultivo libre de bengala rosa. Cubra las microplacas con papel de aluminio para protegerlas de la luz y reserve la mitad de las placas para iluminarlas durante el ensayo de terapia fotodinámica.

Conecte el conector macho del distribuidor de luz al conector hembra de la fuente de luz. Retire la terapia fotodinámica y las microplacas de condición oscura de la incubadora. Desenvuelva la placa de terapia fotodinámica.

Luego, configure el atenuador en el controlador LED al nivel máximo para entregar una irradiancia promedio de 0.62 milivatios por centímetro cuadrado en los 96 pocillos. Después de eso, coloque la placa en el distribuidor de luz. Ilumine la microplaca hasta lograr la dosis de luz deseada en las células.

Una vez alcanzada la dosis de luz deseada, apague el dispositivo. Vuelva a envolver la microplaca de terapia fotodinámica en papel de aluminio y devuélvala junto con la placa de control a la incubadora hasta que se realice la prueba de viabilidad. Después de completar el ensayo de terapia fotodinámica, coloque la placa iluminada en la incubadora durante 24 horas para permitir la respuesta celular posterior al tratamiento.

Después del período de incubación, recupere una placa iluminada y otra no iluminada. Agregue 100 microlitros de reactivo del kit de ensayo de viabilidad celular en cada pocillo para medir el metabolismo mitocondrial y la producción de ATP. Incube las placas en la oscuridad durante 10 minutos antes de continuar con la medición de luminiscencia.

Después de 10 minutos, lea la luminiscencia en cada pocillo usando un lector multimodal. Considere que la luminiscencia de los pocillos de control no tratados representa el 100% de viabilidad. Normalice los valores de luminiscencia de los pocillos tratados a este control para calcular el porcentaje de viabilidad para cada condición de tratamiento.

Repita el mismo protocolo para la medición de la viabilidad celular en puntos de tiempo adicionales posteriores al tratamiento, como 24 horas, 48 horas y 72 horas. La iluminación sola sin bengala rosa no alteró la viabilidad celular de HepG2 en ninguna de las dosis de luz probadas, y la bengala rosa sola sin luz tampoco causó cambios significativos en todas las concentraciones. La terapia fotodinámica mediada por rosa de bengala con CELL-LED-550/3 redujo significativamente la viabilidad de las células HepG2 a todas las dosis de luz, mostrando un fuerte efecto citotóxico.

La superposición entre el perfil de emisión del LED y el espectro de absorción de la rosa de bengala confirmó la compatibilidad espectral del dispositivo CELL-LED-550/3 con el fotosensibilizador. En el futuro, uno de nuestros principales objetivos es desarrollar nuevos paquetes de PDT, cada uno de los cuales comprende compuestos fotosensibles que permitan una orientación específica de las células cancerosas y un dispositivo de iluminación asociado.