Ookluc: Una línea de Plasmodium berghei para la identificación de compuestos que bloquean la transmisión

Nuestra investigación tiene como objetivo identificar y caracterizar los compuestos bloqueadores de la transmisión y los genes esenciales en las etapas sexuales de Plasmodium utilizando un sistema de alto rendimiento para respaldar estrategias novedosas para interrumpir la transmisión de la malaria. Este protocolo aborda la falta de métodos estandarizados y de alto rendimiento para identificar compuestos que bloquean la transmisión mediante el uso de una línea transgénica de P. berghei con detección automatizada de fase de luminiscencia del desarrollo del parásito posterior a la fertilización. Este protocolo permite el cribado de las etapas sexuales de Plasmodium, detecta compuestos bloqueadores de transmisión temprana y admite la determinación precisa de IC50, lo que ofrece ventajas sobre los métodos convencionales.

Para comenzar, prepare las muestras compuestas diluyendo el caldo compuesto a un milimolar usando medio ookinete. Prepare las muestras de trabajo diluyendo este caldo de un milimolar en medio de ookinete en una proporción de uno a 100 para lograr una concentración final de 10 micromolares. Para un ensayo, prepare un volumen final de 200 microlitros de muestra de trabajo por duplicado.

Si el compuesto se disuelve en un disolvente distinto del agua, preparar una muestra de control diluyendo el disolvente en el medio ookinete en la misma proporción utilizada para la muestra de ensayo. Usando dos placas de 96 pocillos, coloque 80 microlitros de cada muestra en pocillos designados para control positivo, control negativo, control de solventes y muestras de prueba por duplicado siguiendo el diseño dado. Agregue cuatro microlitros de sangre de ratón parasitada a cada pocillo en una proporción de uno a 20, excepto los pocillos de control negativo.

Homogeneizar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Para el control negativo, agregue sangre de ratón no infectada a cada pocillo en una proporción de uno a 20 y homogeneice suavemente mediante pipeteo. Coloque las placas en una incubadora a 21 grados centígrados e incube durante seis o 24 horas.

Después de la incubación, homogeneice cada muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo para garantizar una mezcla adecuada del medio sanguíneo. Prepare la mezcla de tampón de lisis y sustrato de luciferasa en una proporción de uno a 50 inmediatamente antes de su uso. Mezcle esta mezcla de sustrato tampón de lisis con cada muestra en una proporción de uno a uno, asegurando una mezcla suave sin introducir burbujas.

Incube la placa a 37 grados centígrados durante tres a cinco minutos. Ahora, transfiera las muestras a una placa de fondo plano blanco de 96 pocillos y mida la luminiscencia con un lector de placas. Después del ensayo de luminiscencia, registre los datos de luminiscencia sin procesar mostrados por el lector de placas.

Usando una hoja de cálculo, calcule la media de cada medición usando la fórmula dada. Reemplace XX por la dirección de la primera celda de medición e YY por la dirección de la segunda celda de medición. Repita la fórmula para todas las muestras.

Convierta los datos en inhibición porcentual utilizando la fórmula dada, donde A es el valor de la unidad de luz relativa de la muestra y B es el valor de la unidad de luz relativa de control. Seleccione compuestos que muestren más del 95% de inhibición para la concentración inhibitoria del 50% de determinación. Después de infectar ratones con Ookluc y recolectar sangre parasitada, prepare muestras compuestas utilizando medio ookinete como diluyente a la concentración inicial que mostró una inhibición de la conversión del 100%.

Pipetee las muestras por triplicado en una placa de 96 pocillos siguiendo el diseño especificado. Con una pipeta, realice diluciones en serie dobles transfiriendo 80 microlitros del pocillo D1 al D2, mezclando bien, luego transfiriendo 80 microlitros de D2 a D3 y continuando este proceso hasta D12. Deseche los últimos 80 microlitros extraídos de D12 para mantener 80 microlitros por pocillo.

Ahora, agregue sangre de ratón parasitada a cada pocillo en una proporción de uno a 20 y homogeneice suavemente mediante pipeteo. En los pocillos de control negativo, agregue sangre de ratón no infectada en una proporción de uno a 20 y homogeneice suavemente. Coloque la placa en una incubadora a 21 grados centígrados e incube durante seis o 24 horas antes de realizar el ensayo de luminiscencia.

Después de calcular el porcentaje de inhibición, abra el software de análisis y cree una tabla XY para trazar. Establezca el eje Y para introducir tres valores de réplica en subcolumnas en paralelo. Pegue los datos en la tabla con x representando la concentración del compuesto e y representando el porcentaje de inhibición.

Ahora, haga clic en Analizar. Seleccione Regresión no lineal, ajuste de curva, elija Curvas de dosis-respuesta, Inhibición, seguido de Inhibidor frente a respuesta normalizada, pendiente variable y haga clic en Aceptar. Vea la curva dosis-respuesta en el panel izquierdo y aplique personalizaciones, como cambios de color o formato de puntos.

Busque la tabla de ajuste no lineal para encontrar el IC50 calculado y el intervalo de confianza del 95%. La pirimidina azepina 90 demostró una clara inhibición dependiente de la concentración de la actividad diana con una inhibición superior al 95% observada a concentraciones de 0,125 a un micromolar, y una pérdida completa de la actividad por debajo de 0,007 micromolar, lo que sugiere un fuerte efecto umbral en su respuesta inhibitoria. La curva dosis-respuesta ajustada a los datos de pirimidina azepina 90 arrojó un valor IC50 de 0,013 micromolares, lo que indica una alta potencia en la inhibición de la actividad objetivo.