Name: Ookluc: Una línea de Plasmodium berghei para la identificación de compuestos que bloquean la transmisión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprende a identificar compuestos bloqueadores de transmisión en estadios sexuales de Plasmodium utilizando la línea transgénica P. berghei con detección automatizada de bioluminiscencia. Este método de alta eficiencia permite determinar IC50 con precisión.

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Todos los experimentos con animales se realizaron en estricta conformidad con las directrices éticas y fueron aprobados por el Comité de Ética en Uso de Animales del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo (CEUA-ICB/USP). Los animales fueron alojados y mantenidos de acuerdo con las normas establecidas por este comité. Los experimentos con parásitos Plasmodium genéticamente modificados, así como su almacenamiento criopreservado a -80 °C, se realizaron de acuerdo con las normas establecidas por el Comité Institucional de Bioseguridad del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo (CIBio-ICB/USP). En este estudio se utilizaron un total de tres ratones hembra BALB/c, de 3 a 5 semanas de edad, dos infectados y uno no infectado.
1. Materiales y reactivos
<ol>
	<li>Prepare el medio ookinete suplementando RPMI 1640 con 0,025 M de HEPES, penicilina-estreptomicina-neomicina (PSN), 50 mg/L de hipoxantina y 100 μM de ácido xanturénico. Ajuste el pH a 8.3 8,16.</li>
	<li>Prepare la solución de trabajo para el ensayo de luminiscencia mezclando 1 volumen de sustrato con 50 volúmenes del tampón de lisis proporcionado en el sistema de ensayo de luciferasa.</li>
	<li>Ajuste una incubadora a 21 °C.</li>
</ol>
2. Infección y recolección de sangre parasitada
<ol>
	<li>Infectar a dos ratones hembra BALB/c (4-6 semanas de edad) con 150 μL de cepa Ookluc criopreservada mediante inyección intraperitoneal (IP) (Día 0). NOTA: En este protocolo, recomendamos el uso de ratones BALB/c debido a su fácil disponibilidad y uso generalizado en instalaciones de animales. Sin embargo, cualquier cepa de ratón de tipo salvaje que sea susceptible a la infección por P. berghei y que favorezca la gametocitogénesis debe ser adecuada para su uso.</li>
	<li>A partir del día 3, evalúe la parasitemia y la gametocitemia mediante el examen microscópico de los frotis de sangre teñidos con Giemsa.</li>
	<li>Cuando la parasitemia y la gametocitemia alcanzan aproximadamente el 5% y el 0,5%, respectivamente (generalmente en el día 4), se recolecta sangre mediante punción cardíaca con jeringas heparinizadas y se agrupa la sangre de ambos ratones infectados. NOTA: Aunque se trata de una línea transgénica de P. berghei, su perfil de crecimiento y gametocitemia son similares a los observados en la cepa ANKA. En este contexto, la proporción de gametocitos en relación con la parasitemia total es aproximadamente 10 veces menor. NOTA: Idealmente, la placa compuesta (ver más abajo) se prepara antes de la recolección de sangre parasitada, de modo que la sangre se pipetea a la placa inmediatamente después de la recolección. Si la sangre de ratón debe recogerse en una habitación diferente, o no puede pipetearse inmediatamente a la placa compuesta por cualquier otro motivo, la sangre recogida debe mantenerse a 37 °C durante no más de 30 minutos.</li>
</ol>
3. Ensayo de conversión: cribado en placas de 96 pocillos
NOTA: Para garantizar resultados consistentes, todo el experimento debe repetirse tres veces en días diferentes para confirmar los hallazgos.
<ol>
	<li>Preparar las muestras de compuestos utilizando medio ookinete como diluyente (una concentración final de 10 μM). Diluir el material compuesto a 1 mM y preparar las muestras de trabajo diluyendo el material de 1 mM 1:100 v:v en medio Ookinete. Para un ensayo por duplicado, prepare un volumen final de 200 μL de muestra de trabajo.</li>
	<li>Si el compuesto se diluye en un disolvente distinto del agua, se incluirá una muestra de control que contenga el disolvente diluido en medio ookinete en la misma proporción que en la muestra de ensayo para asegurarse de que cualquier inhibición observada es atribuible al compuesto y no al disolvente. NOTA: A modo de ejemplo, seleccionaremos 90 compuestos.</li>
	<li>Usando dos placas de 96 pocillos, coloque 80 μL de las muestras en cada pocillo, como se muestra a continuación y se ilustra en la Figura 1, por duplicado (dos placas): Control positivo: 80 μL de medio ookinete; Control negativo: 80 μL de medio ookinete; Control de solventes: 80 μL de medio ookinete con 1% de DMSO; Muestras: 80 μL de 10 μM de cada compuesto en medio ookinete.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig1.jpg"> 
Figura 1: Representación esquemática de un diseño de placa de 96 pocillos diseñado para el cribado de compuestos. El diseño de la placa incluye control positivo (C+), control negativo (C-), control más solvente de dilución (C + S) y 90 compuestos de prueba (S1-S90). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="4">
	<li>Añada 4 μL de sangre de ratón parasitada a cada pocillo de la placa de 96 pocillos en una proporción de 1:20 v:v, excepto al control negativo (C-). Homogeneizar suavemente mediante pipeteo. NOTA: Teniendo en cuenta las pérdidas, calculamos la necesidad de ~400 μL de sangre parasitada por cada placa.</li>
	<li>Para el control negativo, agregue sangre de ratón no infectado en una proporción de 1:20 (v:v, sangre:muestra). Homogeneizar suavemente.</li>
	<li>Incubar a 21 °C durante 6 h o 24 h. NOTA: La actividad de nLuc es detectable a las 6 h de incubación y alcanza su punto máximo a las 24 h del ensayo8. El ensayo no es capaz de identificar compuestos con actividad después de la formación del cigoto, como los compuestos que inhiben la morfogénesis de los ookinetos, porque los cigotos formados acumularán nLuc independientemente de completar la morfogénesis. Por lo tanto, la incubación de 6 h es suficiente para detectar todos los compuestos que bloquearán la actividad de nLuc al inhibir la gametogénesis, la recombinación sexual o tener citotoxicidad temprana. Sin embargo, normalmente favorecemos las incubaciones de 24 h para tener señales más fuertes y una mejor relación señal-ruido.</li>
</ol>
4. Ensayo de luminiscencia
<ol>
	<li>Después del período de incubación, homogeneice las muestras pipeteando hacia arriba y hacia abajo para garantizar una mezcla completa de sangre y medio.</li>
	<li>Prepare la mezcla de tampón de lisis/sustrato de luciferasa inmediatamente antes de usarla en una proporción de 1:50 (v:v, sustrato:tampón de lisis).</li>
	<li>Mezcle la mezcla de sustrato con muestras en una proporción de 1:1 (v:v), asegurando una mezcla suave para evitar burbujas. Incubar a 37 °C durante 3-5 min. NOTA: En este ejemplo, añadimos 84 μL de tampón de sustrato:lisis a cada pocillo.</li>
	<li>Transfiera las muestras a una placa blanca de fondo plano de 96 pocillos. Mida la luminiscencia con un lector de placas. Utilice la siguiente configuración de parámetros: filtro de emisión: lente; tiempo de intervalo de medición: 1 s por pocillo.</li>
</ol>
5. Análisis de datos - cribado
<ol>
	<li>Después del ensayo de luminiscencia, tome nota de los datos brutos que aparecen (Figura 2). NOTA: Las Unidades Ligeras Relativas (RLU) obtenidas dependen del luminómetro utilizado. En nuestro caso, los valores de RLU para el control positivo oscilaron entre 10.000 y 500.000 en un ensayo de incubación de 24 h. Los tiempos de incubación más cortos (6 h) darán como resultado valores de RLU más bajos.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig2.jpg"> 
Figura 2: Resultados obtenidos de una lectura simulada de un ensayo de conversión para el cribado de compuestos. La imagen muestra lecturas de luminiscencia simuladas de un ensayo realizado después de la conversión de ookinetes en presencia de un panel de 90 compuestos. Los valores más bajos de la unidad de luz relativa indican una formación reducida de ookinete. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="2">
	<li>Usando una hoja de cálculo, calcule la media de cada medición usando la siguiente fórmula. Sustitúyase XX por la dirección de la primera célula de medición e YY por la dirección de la segunda célula de medición. Repita la fórmula para todas las muestras. =(PROMEDIO(XX:AA)</li>
	<li>Convierta los datos en % de inhibición para un mejor análisis de los resultados. En la hoja de cálculo, usa la siguiente fórmula. Reemplace A por el valor de RLU de muestra y B por el valor de RLU de control. Repita la fórmula para todos los compuestos probados: = 1 - (A/B) x 100 NOTA: Los datos aparecerán como se muestra en la Figura 3.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig3.jpg"> 
Figura 3: Resultados obtenidos de una lectura simulada de un ensayo de conversión para el cribado de compuestos representados como % de inhibición para cada compuesto. Porcentaje de inhibición de la conversión para cada compuesto ensayado, calculado como se ha descrito anteriormente. Los cuadrados resaltados indican compuestos que promueven más del 95% de inhibición de la conversión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="4">
	<li>Identificar los compuestos que muestran más del 95% de inhibición. NOTA: Estos compuestos exhiben una alta actividad contra las etapas sexuales a una concentración de 10 μM. En nuestro ejemplo, encontramos cinco compuestos con alta actividad frente a las etapas sexuales.</li>
	<li>Para los compuestos identificados, realice una determinación IC50 como se describe a continuación.</li>
</ol>
6. Ensayo de conversión: determinación de IC 50
<ol>
	<li>Infectar ratones con Ookluc y recolectar sangre parasitada, como se describe en la sección 2.</li>
	<li>Prepare las muestras utilizando medio ookinete como diluyente. Utilice una concentración inicial en la que se observe una inhibición del 100% de la conversión por el compuesto. NOTA: Dado que los compuestos activos se identificaron en una pantalla con una concentración de 10 μM, utilizamos 20 μM como concentración inicial para la primera curva dosis-respuesta. Para obtener una curva dosis-respuesta precisa, es importante que su ensayo incluya concentraciones iniciales que resulten en una inhibición del 100% de la conversión y concentraciones finales que conduzcan a una inhibición del 0%. Este enfoque garantiza un cálculo preciso de IC50 . La primera curva dosis-respuesta informará las concentraciones más bajas del compuesto con ~100% de inhibición. En este protocolo, usaremos como ejemplo PyAz90, recientemente identificado usando Ookluc13.</li>
	<li>En una placa de 96 pocillos, agregue por triplicado (ver Figura 4): Control positivo (C+): 80 μL de medio ookinete; Control negativo (C-): 80 μL de medio ookinete; Primera dilución de la muestra (Cpd D1): 160 μL de compuesto a una concentración inicial en medio ookinete que resulta en una inhibición del 100% de la conversión; Pocillos D2 a D12: 80 μL de medio ookinete.</li>
	<li>Realice diluciones en serie dobles pipeteando 80 μL del pocillo D1 en D2, homogeneice y pipetee 80 μL del pocillo D2 en D3 y así sucesivamente. Asegúrese de que todos los pocillos tengan 80 μL de volumen total, así que deseche los últimos 80 μL extraídos del pocillo D12. NOTA: Realice el experimento con al menos tres réplicas para todas las muestras, como se indica en la Figura 4. Para garantizar la fiabilidad y la reproducibilidad de los resultados, se debe repetir todo el experimento en tres días distintos utilizando animales recién infectados cada vez. NOTA: Si en la primera pantalla, los resultados no muestran ningún impacto del disolvente en la conversión, no es necesario incluir estos controles en diluciones seriadas. De lo contrario, también se deben incluir diluciones en serie del solvente.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig4.jpg"> 
Figura 4: Diseño de placa de 96 pocillos diseñado para la determinación del compuesto IC50 . El diseño de la placa incluye diluciones de control positivo (C+), control negativo (C-) y compuesto (Cpd) (D1 a D12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="5">
	<li>Agregue sangre de ratón parasitada a la placa de 96 pocillos a una velocidad de 1:20 v:v. Homogeneizar suavemente mediante pipeteo. NOTA: Se añadirá un total de 4 μL de sangre parasitada a cada pocillo, excepto al control negativo (C-). Teniendo en cuenta las pérdidas, calculamos la necesidad de ~200 μL de sangre parasitada para cada compuesto a analizar.</li>
	<li>En pocillos de control negativos, agregue sangre de ratón no infectada en una proporción de 1:20 (v:v, sangre:muestra). Homogeneizar suavemente.</li>
	<li>Incubar a 21 °C durante 6 h o 24 h.</li>
	<li>Realice el ensayo de luminiscencia, como se describe en la sección 4.</li>
</ol>
7. Análisis de datos - Determinación de IC 50
NOTA: IC50 se define como la concentración de un compuesto necesaria para inhibir el 50% de la actividad/inhibición biológica. En este ensayo, la inhibición se refiere a la reducción de la conversión de ookinete. Los datos se representan como una curva dosis-respuesta sigmoidal, donde el eje X representa la concentración del compuesto (log-transformado) y el eje Y representa el % de inhibición.
<ol>
	<li>Calcule el % de inhibición como se describe en la sección 5, paso 5.3.</li>
	<li>Abra el software y cree una tabla XY.</li>
	<li>Establezca las opciones del eje Y en Introducir 3 valores de réplica en subcolumnas en paralelo.</li>
	<li>Pegue los datos, donde X representa la concentración del compuesto e Y representa el % de inhibición (Figura 5A).</li>
	<li>En la barra de menú, haga clic en Analizar y seleccione Regresión no lineal (ajuste de curva) y luego Curvas de dosis-respuesta - Inhibición y [inhibidor] vs. respuesta normalizada -- pendiente variable; haga clic en Aceptar.</li>
	<li>En el panel izquierdo, observe la curva dosis-respuesta de los datos. Aplique la personalización deseada, como cambios de color y formatos de puntos.</li>
	<li>Localice la tabla de ajuste de Nonlin para encontrar el IC50 calculado y el intervalo de confianza del 95% (IC del 95%) (Figura 5B).</li>
</ol>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig5.jpg"> 
Figura 5: Curva dosis-respuesta de PyAz90. El % de inhibición se midió en función de la concentración de PyAz90 (μM) en una escala logarítmica. La curva sigmoidal representa los datos ajustados utilizados para determinar el IC50, que fue de 0,013 μM (intervalo de confianza del 95%: 0,012-0,014 μM). Los puntos de datos representan la media ± el error estándar de la media de las réplicas experimentales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<ol><li>World malaria report 2024: addressing inequity in the global malaria response. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024">https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024</a> (2025).</li>
<li>Miller, L. H., Ackerman, H. C., Su, X., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+biology+and+disease+pathogenesis%3A+insights+for+new+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments.</a> Nature Med. 19 (2), 156-167 (2013).</li>
<li>Tsoumani, M. E., Voyiatzaki, C., Efstathiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Vaccines%3A+From+the+Past+towards+the+mRNA+Vaccine+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Malaria Vaccines: From the Past towards the mRNA Vaccine Era.</a> Vaccines. 11 (9), 1452(2023).</li>
<li>Ménard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+under+the+skin%3A+the+first+steps+in+malarial+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Looking under the skin: the first steps in malarial infection and immunity.</a> Nature Rev. Microbiol. 11 (10), 701-712 (2013).</li>
<li>Appetecchia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission-blocking+strategies+for+malaria+eradication%3A+Recent+advances+in+small-molecule+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Transmission-blocking strategies for malaria eradication: Recent advances in small-molecule drug development.</a> Pharmaceuticals. 17 (7), 962(2024).</li>
<li>Baniecki, M. L., Wirth, D. F., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Plasmodium+falciparum+growth+assay+for+malaria+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput Plasmodium falciparum growth assay for malaria drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (2), 716-723 (2007).</li>
<li>Delves, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activities+of+current+antimalarial+drugs+on+the+life+cycle+stages+of+Plasmodium%3A+A+comparative+study+with+human+and+rodent+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">The activities of current antimalarial drugs on the life cycle stages of Plasmodium: A comparative study with human and rodent parasites.</a> PLoS Med. 9 (2), e1001169(2012).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+the+pathogen+box+for+molecules+active+against+Plasmodium+sexual+stages+using+a+new+nanoluciferase-based+transgenic+line+of+P.+berghei+identifies+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Screening the pathogen box for molecules active against Plasmodium sexual stages using a new nanoluciferase-based transgenic line of P. berghei identifies transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 62 (11), e01053-e01118 (2018).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+transmission-blocking+antimalarials+identified+by+high-throughput+screening+of+Plasmodium+berghei+Ookluc%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Novel transmission-blocking antimalarials identified by high-throughput screening of Plasmodium berghei Ookluc.</a> Antimicrob Agents Chemother. 67 (4), e0146522(2023).</li>
<li>Lima, M. N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+multi-kinase+approach+for+the+identification+of+potent+antiplasmodial+hits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Integrative multi-kinase approach for the identification of potent antiplasmodial hits.</a> Front Chem. 7, 773(2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+chemogenomics+drug+repositioning+strategy+enables+the+discovery+of+epirubicin+as+a+new+repurposed+hit+for+Plasmodium+falciparum%C3%82%C2%A0and%C3%82%C2%A0P.+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Computational chemogenomics drug repositioning strategy enables the discovery of epirubicin as a new repurposed hit for Plasmodium falciparumÂ andÂ P. vivax.</a> Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), aac.02041-aac.02119 (2020).</li>
<li>Krishnan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torin+2+derivative%2C+NCATS-SM3710%2C+has+potent+multistage+antimalarial+activity+through+inhibition+of+P.+falciparum+phosphatidylinositol+4-kinase+%28Pf+ACS+Pharmacol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Torin 2 derivative, NCATS-SM3710, has potent multistage antimalarial activity through inhibition of P. falciparum phosphatidylinositol 4-kinase (Pf ACS Pharmacol).</a> Transl Sci. 3 (5), 948-964 (2020).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+azepine+targets+the+Plasmodium+bc1+complex+and+displays+multistage+antimalarial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22JACS+Au%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine azepine targets the Plasmodium bc1 complex and displays multistage antimalarial activity.</a> JACS Au. 4 (10), 3942-3952 (2024).</li>
<li>Lima, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcones+as+a+basis+for+computer-aided+drug+design%3A+Innovative+approaches+to+tackle+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chalcones as a basis for computer-aided drug design: Innovative approaches to tackle malaria.</a> Future Med Chem. 11 (20), 2635-2646 (2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+4-aminoquinoline+chemotype+with+multistage+antimalarial+activity+and+lack+of+cross-resistance+with+PfCRT+and+PfMDR1+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A novel 4-aminoquinoline chemotype with multistage antimalarial activity and lack of cross-resistance with PfCRT and PfMDR1 mutants.</a> PLoS Pathog. 20 (10), e1012627(2024).</li>
<li>Blagborough, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+transmission+blockade+in+Plasmodium+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing transmission blockade in Plasmodium spp.</a> Methods Mol Biol. 923, 577-600 (2013).</li>
<li>Azevedo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+method+for+in+vitro+screening+of+Plasmodium+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (6), aac.02699-aac.02616 (2017).</li>
<li>Gaitán, X. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+merozoite+thrombospondin+related+anonymous+protein+%28MTRAP%29+of+Plasmodium+berghei+as+a+transmission-blocking+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the merozoite thrombospondin related anonymous protein (MTRAP) of Plasmodium berghei as a transmission-blocking antigen.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. , 119(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism versión 10.0.0 para Windows</td><td></td><td></td><td>Software GraphPad, Boston, Massachusetts, EE. UU.</td></tr><tr><td>Sal de heparina sódica de la mucosa intestinal porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Hipoxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>Ratón</td><td>---</td><td>---</td><td>Ratones hembra BALB/c, de 3 a 5 semanas de edad</td></tr><tr><td>Sistema de ensayo de luciferasa Nano-Glo</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina &menos; Estreptomicina &menos; Solución de neomicina estabilizada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas POLARStar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, Suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>61870036</td><td></td></tr><tr><td>Ácido xanturénico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D120804</td><td></td></tr></tbody></table>

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Malaria remains a world health challenge; in 2023, 263 million cases and 597,000 deaths were reported around the globe. The parasite's life cycle is ...

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Seguimiento In Vivo del Desarrollo del Edema y Patología Microvascular en un Modelo de Malaria Cerebral Experimental usando Imágenes de Resonancia Magnética

Debido a las sorprendentes similitudes del ciclo de vida y la biología de los parásitos del paludismo de roedores con los parásitos del paludismo humano, los modelos de malaria de roedores se han vuelto indispensables para la investigación del paludismo. En este documento, estandarizamos algunas de las técnicas más importantes utilizadas en el análisis fenotípico de especies de malaria de roedores de tipo salvaje y transgénico.

Análisis fenotípico de las etapas de la sangre asexual y sexual del parásito de la malaria de los roedores y las etapas de los mosquitos

Las investigaciones detalladas sobre las etapas de los mosquitos de los parásitos de la malaria son fundamentales para diseñar estrategias efectivas de bloqueo de la transmisión. Este protocolo demuestra cómo cultivar eficazmente gametocitos infecciosos y luego alimentar a estos gametocitos a los mosquitos para generar etapas de mosquito de P. falciparum.

Plasmodium falciparum Cultivo de gametocitos e infección por mosquitos a través de la alimentación artificial por membrana

Uso de molienda de haz de iones enfocado para producir láminas vítreas en la rejilla a partir de muestras biológicas congeladas por inmersión para tomografía crioelectrónica.

Preparación de laminillas a partir de muestras biológicas vítreas utilizando un microscopio electrónico de barrido de doble haz para la criotomografía electrónica

Este protocolo describe un ensayo de inmunoadsorción enzimática en sándwich para detectar esporozoítos de glándulas salivales en mosquitos. Mediante el uso de anticuerpos monoclonales fácilmente disponibles, el método permite la detección rentable y de alto rendimiento de mosquitos portadores de Plasmodium falciparum o Plasmodium vivax. El método es adecuado para la investigación de la transmisión del paludismo, incluidos los estudios de vectores.

Detección de esporozoítos de Plasmodium en mosquitos Anopheles mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas

El ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA) se considera el estándar de oro para la evaluación e identificación de posibles compuestos antipalúdicos. Este sistema de alimentación artificial se utiliza para infectar mosquitos para evaluar más a fondo los efectos de tales compuestos sobre la intensidad y prevalencia del parásito Plasmodium falciparum .

Ensayo estándar de alimentación por membrana para la detección de la infección por Plasmodium falciparum en mosquitos vectores Anopheles

Aquí describimos un nuevo método para ayudar a dilucidar los mecanismos de inmunidad celular a Plasmodium durante la etapa sanguínea de la infección. Este es un ensayo in vitro que mide la destrucción de glóbulos rojos infectados por linfocitos citotóxicos.

In vitro Ensayo de destrucción de glóbulos rojos infectados con plasmodio por linfocitos citotóxicos

La malaria se transmite a través de la inoculación de la etapa de esporozoíto de Plasmodium por mosquitos infectados. El Plasmodium transgénico nos ha permitido comprender mejor la biología de la malaria y ha contribuido directamente a los esfuerzos de desarrollo de vacunas contra la malaria. En este trabajo se describe una metodología simplificada para generar esporozoítos transgénicos de Plasmodium berghei .

Generación de esporozoítos de Plasmodium berghei modificados genéticamente

La genética química implica la sustitución de un residuo guardián por un aminoácido que contiene una cadena lateral diferente en el locus objetivo. Aquí, hemos generado un parásito mutante que contiene un alelo hipomórfico de cdpk1 e identificado las vías compensatorias adoptadas por el parásito en el fondo mutante.

Comprender el desarrollo de vías compensatorias en un parásito mutante de la malaria que alberga un alelo hipomórfico de quinasas similares a las plantas

Aprende a identificar compuestos bloqueadores de transmisión en estadios sexuales de Plasmodium utilizando la línea transgénica P. berghei con detección automatizada de bioluminiscencia. Este método de alta eficiencia permite determinar IC50 con precisión.

Ookluc: Una línea de Plasmodium berghei para la identificación de compuestos que bloquean la transmisión

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