Disección y disociación rápidas del epitelio olfativo de ratón para suspensiones de un solo núcleo
1 de agosto de 2025
Este artículo proporciona un protocolo simplificado para la disección y disociación del epitelio olfativo murino con el fin de secuenciar el ARN de un solo núcleo.
Aquí proporcionamos un protocolo diseñado para ayudar con la disección rápida del epitelio olfativo con el fin de secuenciar una sola célula o un solo núcleo. Nuestro protocolo prioriza la velocidad y la facilidad de aprendizaje, y es ideal para aplicaciones unicelulares donde el tejido está homogeneizado y la disección rápida es más importante que preservar la integridad anatómica, a diferencia de los métodos anteriores. Nuestro protocolo permite una disección rápida y fácil de usar del epitelio olfativo, con el objetivo de facilitar los estudios de secuenciación unicelular y promover la investigación de las bases genéticas del sistema olfativo.
Para comenzar, obtenga la cabeza despellejada de un ratón. Use un par de tijeras finas y afiladas para hacer dos incisiones para romper los arcos cigomáticos del hueso escamoso bilateralmente colocando una punta de tijera en la órbita posterior y la otra adyacente al canal auditivo. Haga una incisión poco profunda de órbita a órbita a lo largo de la cara más anterior del hueso frontal, haciendo una incisión solo en la superficie dorsal del hueso frontal a una profundidad de aproximadamente uno a dos milímetros.
Ahora, corte a lo largo de la línea media del cráneo desde el foramen magnum a través de las suturas sagital e interfrontal hasta llegar a la incisión interorbitaria realizada anteriormente. Inserte un par de fórceps en la incisión de la línea media y tire firmemente de un hemisferio de la bóveda craneal lateralmente. Mientras sostiene el hueso nasal y los dientes incisivos, use fórceps para romper la bóveda craneal contralateral.
Permita que el cerebro, incluidos los bulbos olfatorios, se extirpe con el hemisferio del hueso a medida que se arranca. A continuación, use pinzas para huesos o Rongeurs para eliminar cualquier resto de hueso frontal y hueso premaxilar hasta la base de los dientes incisivos. Corte a lo largo de la sutura frontonasal con pinzas para huesos para liberar el hueso nasal de la placa cribiforme.
Luego use fórceps para levantar el hueso nasal de la placa cribiforme para exponer el epitelio olfatorio. Si el hueso premaxilar residual obstruye el epitelio olfatorio dorsal, retírelo antes de continuar. Ahora, use un par de fórceps de punta fina para asegurar suavemente la cara dorsal del tabique nasal en su unión con la placa cribiforme y tire de ella hacia atrás.
El epitelio olfativo principal se liberará como una estructura totalmente intacta. La citometría de flujo por imágenes identificó que el 53,69% de todos los eventos fueron núcleos. Entre los núcleos individuales, el 53,89% tenía alta circularidad.
Los gráficos de control de calidad confirmaron una calidad de secuenciación constante en cuatro muestras, con distribuciones uniformes de recuentos de genes y mitocondrias. Los genes marcadores del conjunto de datos son consistentes con muchos de los genes marcadores bien establecidos para cada tipo de célula.
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Descripción general
Este artículo describe un protocolo para la disección y disociación rápida del epitelio olfativo murino destinado a facilitar la secuenciación de ARN a nivel de núcleo individual. El método prioriza la rapidez y facilidad de ejecución, lo que lo hace adecuado para aplicaciones en las que es necesario homogenizar el tejido.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Genómica
- Investigación del sistema olfativo
Antecedentes
- La secuenciación de ARN de célula individual y de núcleo individual es fundamental para comprender la diversidad celular.
- Los métodos previos de disección enfatizaban la integridad anatómica, lo cual puede no ser ideal para ciertas aplicaciones.
- El epitelio olfatorio desempeña un papel fundamental en la transducción sensorial olfativa.
- Mejorar las técnicas de disección puede aumentar la eficiencia de los estudios genéticos relacionados con el olfato.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo fácil de usar para la disección del epitelio olfatorio.
- Facilitar el procesamiento rápido del tejido para investigaciones de secuenciación a nivel de una sola célula.
- Fomentar la investigación sobre los mecanismos genéticos del sistema olfatorio.
Métodos Utilizados
- El método emplea la disección del epitelio olfativo a partir de modelos murinos.
- Este modelo biológico involucra el sistema olfativo del ratón, destacando la necesidad de una extracción rápida.
- La eliminación del hueso y la manipulación cuidadosa aseguran la integridad del epitelio olfativo principal.
- Los pasos clave incluyen incisiones en la bóveda craneal y la extracción de las estructuras olfativas.
- Se implementaron controles de calidad para mantener una calidad constante en la secuenciación.
Resultados Principales
- Más de la mitad de los eventos recolectados fueron identificados como núcleos, lo que indica un aislamiento exitoso.
- La alta circularidad de los núcleos sugiere una buena preservación durante la disección.
- El control de calidad mostró distribuciones uniformes de genes y mitocondrias.
- Los genes marcadores coincidieron con los parámetros establecidos para los tipos celulares.
Conclusiones
- El estudio presenta un avance metodológico rápido para la disección del epitelio olfativo.
- Al permitir la secuenciación eficiente de núcleos individuales, contribuye a comprender los factores genéticos en la olfacción.
- Este protocolo podría mejorar el análisis de los mecanismos neuronales y la plasticidad en los sistemas sensoriales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La preparación rápida y reproducible de suspensiones de núcleos individuales a partir del epitelio olfativo de ratón permite el perfilado molecular de alta resolución de diversas poblaciones neuronales y progenitoras. Este protocolo aborda un cuello de botella clave en la genómica unicelular al minimizar el tiempo de extracción del tejido y preservar la integridad nuclear, lo que favorece una validación robusta de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en los flujos de trabajo de neurociencia sensorial. El enfoque mejora la confianza predictiva en investigaciones tempranas de descubrimiento e investigación traslacional centradas en la base genética de la función y regeneración olfativas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la prueba rápida de hipótesis sobre la expresión génica en neuronas sensoriales olfativas y progenitores.
- Apoya la validación funcional de objetivos al preservar la calidad nuclear para secuenciación posterior.
- Facilita la eliminación de riesgos mecanicistas en las vías candidatas implicadas en la renovación de neuronas sensoriales.
- Mejora la confianza predictiva para priorizar objetivos en la investigación del sistema sensorial.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Proporciona suspensiones de núcleos individuales de alta calidad adecuadas para flujos de trabajo estandarizados de secuenciación unicelular.
- Asegura la reproducibilidad y escalabilidad entre múltiples muestras y corridas experimentales.
- Ofrece resultados cuantitativos, incluyendo el rendimiento nuclear y métricas de calidad, para la evaluación de ensayos.
- Permite la evaluación confiable de los cambios en la expresión génica en respuesta a perturbaciones experimentales.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad al estudiar la disfunción y la regeneración olfativa.
- Apoya la continuidad desde la genómica en fase de descubrimiento hasta la validación preclínica de dianas moleculares.
- Reduce el riesgo biológico al proporcionar datos consistentes y de alta calidad para la identificación de biomarcadores traslacionales.
- Facilita decisiones de avance ajustadas al riesgo en carteras de neurociencia sensorial.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo se integra en la interfaz entre el descubrimiento temprano y la identificación de compuestos activos, posibilitando una transición fluida desde la extracción de tejidos hasta la secuenciación de núcleos individuales y el análisis posterior.
- Biología del Descubrimiento: Acelera la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en la investigación del sistema olfativo.
- Tamizaje: Proporciona suspensiones nucleares listas para ensayos con métricas de calidad validadas.
- Análisis: Ofrece lecturas cuantitativas para comparar la expresión génica entre tipos celulares y condiciones.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación de biomarcadores y el desarrollo de modelos preclínicos para trastornos olfativos.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo estandarizado y reutilizable para la preparación de núcleos individuales en tejidos sensoriales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y el rendimiento en genómica de célula individual.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance/no avance y una gestión eficiente del portafolio en términos de capital.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de programas en neurociencia sensorial.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia técnica en disección rápida y aislamiento de núcleos a partir de estructuras anatómicas complejas.
- Exige acceso a instrumentación especializada para el procesamiento de tejidos y control de calidad (por ejemplo, citometría de flujo con imágenes).
- Necesita una estandarización entre equipos para garantizar la reproducibilidad entre estudios y operadores.
- Puede requerir adaptaciones para su uso con otros tipos de tejidos o sistemas modelo con características anatómicas distintas.
- La extracción enfocada en la velocidad puede limitar aplicaciones en las que la integridad anatómica es fundamental.
