Name: Disección y disociación rápidas del epitelio olfativo de ratón para suspensiones de un solo núcleo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: Aprende a diseccionar y disociar rápidamente el epitelio olfativo de ratón para secuenciación de ARN de núcleo único. Este protocolo facilita estudios genómicos del sistema olfativo con alta calidad.

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Todos los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados y realizados de conformidad con el Baylor College of Medicine IACUC. Se utilizaron ratones hembra C57BL/6J (JAX:000664). Los detalles de los reactivos y equipos se enumeran en la Tabla de materiales.
1. Disección del epitelio olfatorio
<ol>
	<li>Comience anestesiando profundamente al ratón utilizando cualquier método preferido (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Confirme el plano quirúrgico de la anestesia mediante un pellizco firme en el dedo del pie y proceda con la perfusión transcardíaca de al menos 10 ml de PBS 1x helado. Retire la piel para exponer el cráneo (Figura 2A). NOTA: La extracción de la cabeza del cuerpo es opcional. Si uno decide quitar la cabeza, se recomienda quitar la piel y otros tejidos blandos alrededor del cráneo antes de la decapitación.</li>
	<li>Con unas tijeras finas y de punta afilada, haga dos incisiones para romper los arcos cigomáticos del hueso escamoso bilateralmente colocando una punta de tijera en la órbita posterior y la otra adyacente al canal auditivo (líneas verdes en la Figura 2B).</li>
	<li>Hacer una incisión poco profunda de órbita a órbita a lo largo de la cara más anterior del hueso frontal. Haga una incisión solo en la superficie dorsal del hueso frontal (~ 1-2 mm de profundidad), teniendo cuidado de no cortar ninguna estructura subyacente o hueso que comprenda la órbita (línea azul en la Figura 2B). NOTA: Para lograr una incisión poco profunda entre las órbitas, sostenga las tijeras perpendiculares al cráneo y use solo las puntas afiladas para cortar.</li>
	<li>Cortar a lo largo de la línea media del cráneo desde el foramen magno, a través de las suturas sagital e interfrontal, hasta llegar a la incisión interorbitaria realizada en el hueso frontal en el paso 1.3 (línea roja en la Figura 2B).</li>
	<li>Inserte un par de fórceps en la incisión realizada a lo largo de la línea media del cráneo y tire firmemente de un hemisferio de la bóveda craneal lateralmente. Esta acción también eliminará los huesos de la órbita (frontal, maxilar y lagrimal), exponiendo los aspectos laterales de los cornetes olfativos (Figura 2D). NOTA: Tenga cuidado de no dañar inadvertidamente el equipo original a partir de este momento.</li>
	<li>Sosteniendo el hueso nasal y los dientes incisivos, rompa la bóveda craneal contralateral con fórceps. Permita que el cerebro (incluidos los bulbos olfatorios) se extirpe con el hemisferio del hueso a medida que se arranca (Figura 1E). Las únicas estructuras óseas visibles que deben permanecer después de este paso son la base del cráneo y los huesos que rodean el OE (Figura 2F).</li>
	<li>Con un par de pinzas para huesos o rongeurs, retire cualquier resto de hueso frontal y hueso premaxilar (incisivo) hasta la base de los dientes incisivos (Figura 2G).</li>
	<li>Use pinzas óseas para cortar a lo largo de la sutura frontonasal para liberar el hueso nasal de la placa cribiforme, teniendo mucho cuidado de no dañar el OE expuesto subyacente ni fracturar la placa cribiforme.</li>
	<li>Levante el hueso nasal de la placa cribiforme con fórceps para exponer el OE (Figura 2H). Si el hueso premaxilar residual oscurece el OE dorsal, retírelo antes de continuar (círculos negros en la Figura 1I).</li>
	<li>Con pinzas de punta fina, asegure suavemente la cara dorsal del tabique nasal en su unión con la placa cribiforme y tire hacia atrás (Figura 2J, K). Con una resistencia mínima, el epitelio olfativo principal se liberará como una estructura totalmente intacta (Figura 2L).</li>
	<li>Proceda inmediatamente con la disociación OE o congele rápidamente el tejido para su posterior procesamiento.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig2.jpg"> 
Figura 2: Técnica para la disección rápida del epitelio olfatorio. (A) La cabeza del ratón después de la eliminación del tejido blando circundante. (B) Guías codificadas por colores para incisiones de la bóveda craneal. (C) Apariencia después de incisiones en la bóveda craneal. (D) Extirpación del primer hemisferio de la bóveda craneal junto con la porción de la órbita adyacente al epitelio olfativo. (E) Extirpación de la porción contralateral de la bóveda craneal junto con el cerebro. (F) La cabeza después de la extirpación del cerebro y la bóveda craneal. (G) Extirpación del hueso frontal más anterior y el premaxilar posterior, después de la incisión en la sutura frontomaxilar. (H) Extirpación de los huesos nasales. (I) Los círculos negros resaltan áreas de hueso premaxilar residual que se pueden extirpar opcionalmente. (J) Colocación de fórceps para la extirpación del epitelio olfativo intacto. (K) Tire hacia atrás para liberar el epitelio olfatorio. (L) Liberación total del epitelio olfativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. Disociación del epitelio olfatorio y aislamiento de un solo núcleo
<ol>
	<li>Coloque un tubo C y dos tubos cónicos de 15 ml por muestra en hielo.</li>
	<li>Prepare el tampón de lisis agregando un inhibidor de ARNasa (hasta una concentración final de 0,2 U/μL) al tampón de extracción de núcleos prefabricados.</li>
	<li>Agregue 4 ml de BSA al 1% a cada tubo cónico de 15 ml, agite brevemente y deseche el exceso. Esto recubre cada uno de los tubos cónicos de 15 ml con BSA para minimizar la adhesión de los núcleos al tubo.</li>
	<li>Para un OE completo, agregue 2 ml de tampón de lisis helada a cada tubo C.</li>
	<li>Agregue muestras de equipo original a los tubos en C. Con las pinzas # 2, sostenga cada muestra sobre su respectivo tubo en C y córtela en trozos pequeños con unas tijeras de punta fina.</li>
	<li>Coloque los tubos C que contienen cada muestra boca abajo sobre los bloques disociadores de tejidos automatizados. En la pantalla del disociador, el cuadrado correspondiente a cada bloque cambiará de Libre a Seleccionado.</li>
	<li>Presione el icono de la carpeta para ir a la carpeta Miltenyi . Usando las flechas, desplácese hasta el programa 4C_nuclei_1 (un programa precargado dentro del disociador). Presione OK para aplicar el programa a cada bloque y luego presione Start para comenzar el ciclo. Retire los tubos C del disociador inmediatamente después de completar el ciclo. NOTA: Si es posible, mantenga los tubos C helados durante el ciclo de disociación. Es importante retirar las muestras del disociador inmediatamente después de completar el ciclo y continuar con los siguientes pasos del protocolo para evitar la sobrelisis de los núcleos.</li>
	<li>Con una pipeta, aspire la suspensión homogeneizada del tubo C y fíltrela a través de un filtro de 70 μm en el primer tubo cónico recubierto de BSA. Evite aspirar los fragmentos óseos que se han acumulado en la parte inferior del tubo C.</li>
	<li>Enjuague el colador con 1 ml de PBS 1x helado para garantizar una filtración completa.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión filtrada a 500 × g durante 5 min a 4 °C en una centrífuga de cubo oscilante.</li>
	<li>Aspire suavemente y deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Vuelva a suspender completamente el pellet del núcleo en 1 ml de PBS 1x helado mediante un pipeteo suave.</li>
	<li>Pasar los núcleos resuspendidos a través de un filtro de 30 μm en el segundo tubo cónico recubierto de BSA. La concentración de núcleos se puede cuantificar utilizando un hemocitómetro o un contador celular automatizado.</li>
	<li>Proceda inmediatamente con el protocolo descendente elegido (con o sin FACS) para preservar la integridad de la muestra y evitar la degradación (Figura 3). NOTA: Se recomienda encarecidamente que los usuarios realicen ejecuciones de práctica de todo este protocolo para garantizar una finalización fluida y oportuna.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig3.jpg"> 
Figura 3: Disociación del epitelio olfatorio y flujo de trabajo de aislamiento de un solo núcleo. Después de la disección, el epitelio olfativo se disocia mecánica y químicamente. A continuación, el lisado se filtra a través de un colador de 70 μm, se enjuaga con 1x PBS y se centrifuga a 500 × g durante 5 min. El pellet se resuspende en 1x PBS antes de ser filtrado a través de un filtro de 30 μm. La suspensión de núcleos resultante está disponible para diversas aplicaciones de secuenciación posteriores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<ol><li>Graziadei, P. P. C., Graziadei, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+I.+Morphological+aspects+of+differentiation+and+structural+organization+of+the+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. I. Morphological aspects of differentiation and structural organization of the olfactory sensory neurons.</a> J Neurocytol. 8 (1), 1-18 (1979).</li>
<li>Monti Graziadei, G. A., Graziadei, P. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+II.+Degeneration+and+reconstitution+of+the+olfactory+sensory+neurons+after+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. II. Degeneration and reconstitution of the olfactory sensory neurons after axotomy.</a> J Neurocytol. 8 (2), 197-213 (1979).</li>
<li>Caggiano, M., Kauer, J. S., Hunter, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globose+basal+cells+are+neuronal+progenitors+in+the+olfactory+epithelium%3A+a+lineage+analysis+using+a+replication-incompetent+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Globose basal cells are neuronal progenitors in the olfactory epithelium: a lineage analysis using a replication-incompetent retrovirus.</a> Neuron. 13 (2), 339-352 (1994).</li>
<li>Iwai, N., Zhou, Z., Roop, D. R., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+basal+cells+are+multipotent+progenitors+in+normal+and+injured+adult+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Horizontal basal cells are multipotent progenitors in normal and injured adult olfactory epithelium.</a> Stem Cells. 26 (5), 1298-1306 (2008).</li>
<li>Schwob, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cells+of+the+mammalian+olfactory+epithelium%3A+Taking+poietic+license%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cells of the mammalian olfactory epithelium: Taking poietic license.</a> J Comp Neurol. 525 (4), 1034-1054 (2017).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+olfactory+stem+cell+trajectories+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Deconstructing olfactory stem cell trajectories at single-cell resolution.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 817-830.e8 (2017).</li>
<li>Gadye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+activates+transient+olfactory+stem+cell+states+with+diverse+lineage+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Injury activates transient olfactory stem cell states with diverse lineage capacities.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 775-790.e9 (2017).</li>
<li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+deconstruction+of+mouse+olfactory+sensory+neurons%3A+from+whole+mucosa+to+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: from whole mucosa to single-cell RNA-seq.</a> Sci Rep. 5 (1), 18178(2015).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+regulates+olfactory+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">p63 regulates olfactory stem cell self-renewal and differentiation.</a> Neuron. 72 (5), 748-759 (2011).</li>
<li>Brann, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neuronal+expression+of+SARS-CoV-2+entry+genes+in+the+olfactory+system+suggests+mechanisms+underlying+COVID-19-associated+anosmia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Non-neuronal expression of SARS-CoV-2 entry genes in the olfactory system suggests mechanisms underlying COVID-19-associated anosmia.</a> Sci Adv. 6 (31), eabc5801(2020).</li>
<li>Carter, L. A., MacDonald, J. L., Roskams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+horizontal+basal+cells+demonstrate+a+conserved+multipotent+progenitor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory horizontal basal cells demonstrate a conserved multipotent progenitor phenotype.</a> J Neurosci. 24 (25), 5670-5683 (2004).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Sci Rep. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Ruiz Tejada Segura, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+transcriptomics+atlas+of+the+mouse+nose+sheds+light+on+the+anatomical+logic+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A 3D transcriptomics atlas of the mouse nose sheds light on the anatomical logic of smell.</a> Cell Rep. 38 (12), 110547(2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+census+of+mammalian+olfactory+epithelium+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic census of mammalian olfactory epithelium aging.</a> Dev Cell. 59 (22), 3043-3058.e8 (2024).</li>
<li>Dunston, D., Ashby, S., Krosnowski, K., Ogura, T., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+manual+deboning+method+to+prepare+intact+mouse+nasal+tissue+with+preserved+anatomical+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization.</a> J Vis Exp. (78), e50538(2013).</li>
<li>Gurumurthy, R. K., Kumar, N., Chumduri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+isolation+of+high-quality+single+cells+from+the+female+mouse+reproductive+tract+tissues+for+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for isolation of high-quality single cells from the female mouse reproductive tract tissues for single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100970(2021).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).</li>
<li>Belfort, B. D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+AAV+serotypes+for+transduction+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of AAV serotypes for transduction of olfactory sensory neurons.</a> Front Neurosci. 19, 1531122(2025).</li>
<li>Huang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+olfactory+sensory+neurons+provide+behaviourally+relevant+sensory+input+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immature olfactory sensory neurons provide behaviourally relevant sensory input to the olfactory bulb.</a> Nat Commun. 13 (1), 6194(2022).</li>
<li>Barrios, A. W., Nunez, G., Sanchez Quinteiro, P., Salazar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy%2C+histochemistry%2C+and+immunohistochemistry+of+the+olfactory+subsystems+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Anatomy, histochemistry, and immunohistochemistry of the olfactory subsystems in mice.</a> Front Neuroanat. 8, 63(2014).</li>
<li>Antunes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+nasal+septa+for+respiratory+epithelial+air-liquid+interface+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures.</a> Biotechniques. 43 (2), 195-204 (2007).</li>
<li>Wu, J., Cai, Y., Wu, X., Ying, Y., Tai, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Bakulski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+the+gene+expression+effects+of+developmental+lead+%28Pb%29+exposure+on+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of the gene expression effects of developmental lead (Pb) exposure on the mouse hippocampus.</a> Toxicol Sci. 176 (2), 396-409 (2020).</li>
<li>Chang, C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+uncovers+the+individual+alteration+of+intestinal+mucosal+immunocytes+in+Dusp6+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing uncovers the individual alteration of intestinal mucosal immunocytes in Dusp6 knockout mice.</a> iScience. 25 (2), 103738(2022).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-sequencing+profiling+of+mouse+lung.+Reduced+dissociation+bias+and+improved+rare+cell-type+detection+compared+with+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-sequencing profiling of mouse lung. Reduced dissociation bias and improved rare cell-type detection compared with single-cell RNA sequencing.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).</li>
<li>Xiong, A., Zhang, J., Chen, Y., Zhang, Y., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+single-cell+transcriptomic+analyses+reveal+that+GPNMB-high+macrophages+promote+PN-MES+transition+and+impede+T+cell+activation+in+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM.</a> eBioMedicine. 83, 104239(2022).</li>
</ol>

El epitelio olfativo murino (OE) es un componente esencial del sistema olfativo y es responsable de detectar y transducir señales odorantes al sistema nervioso central. Su capa más superficial contiene los cilios detectores de olores de las neuronas sensoriales olfativas, que están cubiertos por una capa de moco y rodeados por las células sustentaculares y microvillares de soporte 1,2. Las OSN son bipolares, extendiendo sus cilios apicalmente para formar una red dentro de la capa de moco y sus axones basalmente a través de la placa cribiforme ósea para fusionarse en glomérulos dentro del bulbo olfatorio. Estos glomérulos son el sitio de las sinapsis entre las OSN y las neuronas aguas abajo. Las OSN subyacentes, las células progenitoras neuronales llamadas células basales globosas reponen constantemente las OSN a medida que mueren3 después de la exposición directa a agresiones ambientales como toxinas en el aire, patógenos y traumatismos físicos. Las células basales globosas se derivan de un grupo de reserva de células basales horizontales multipotentes 4,5, ubicadas más basalmente y adheridas a la lámina basal de protuberancias óseas llamadas cornetes nasales. Los cornetes nasales son tortuosos, lo que dificulta la separación y homogeneización de los OE. Además, el OE está rodeado por huesos del cráneo, lo que dificulta el acceso al área y tradicionalmente requiere un procedimiento que requiere mucho tiempo.
Estudios anteriores se han basado en una incubación prolongada de papaína para liberar el epitelio olfativo del hueso 6,7,8,9,10, lo que puede retrasar aún más el procesamiento posterior de la suspensión unicelular. Debido a que el cizallamiento de los axones de OSN desencadena la apoptosis11, es imperativo minimizar la cantidad de tiempo desde la extracción del tejido hasta la preparación de la biblioteca de ADNc. Además, la arquitectura del OE y sus proyecciones al bulbo olfatorio complican la extracción de células intactas para una secuenciación exitosa de ARN unicelular. Afortunadamente, la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) se ha convertido en una herramienta poderosa para perfilar células al tiempo que preserva la distribución del tipo de células, particularmente en tejidos donde la disociación de una sola célula es difícil o poco práctica12,13.
Si bien varios estudios 6,7,8,10,14,15 han realizado la secuenciación unicelular del OE de ratón, ninguno ofrece un procedimiento de disección detallado optimizado para una recolección de tejido consistente y conveniente, lo cual es necesario dada la fragilidad del OE y el encapsulamiento por varios huesos del cráneo. Además, las guías de disecciónexistentes 16 se centran en preservar la estructura anatómica en lugar de la velocidad, lo que lleva a tiempos de disección potencialmente largos. Debido a que la preparación oportuna del tejido es esencial para minimizar la degradación del ARN y maximizar la calidad de los núcleos preparados17,18, se justifica un protocolo optimizado para la rápida disección y homogeneización del OE murino en una suspensión de un solo núcleo para su uso en diversas aplicaciones posteriores.
Este protocolo (Figura 1) presenta un método simplificado diseñado para superar estos desafíos, lo que permite la disección rápida del OE murino y la disociación eficiente del tejido con el fin de aislar los núcleos. Este enfoque facilita la secuenciación de un solo núcleo de alta calidad19, proporcionando una técnica confiable para investigar los fundamentos moleculares de la biología olfativa.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig1.jpg"> 
Figura 1: Anatomía de las suturas y huesos relevantes del cráneo de ratón C57BL / 6 y sección transversal representativa del epitelio olfativo. (A) Las suturas del cráneo están codificadas por colores. Las suturas están codificadas por colores en un lado del cráneo, mientras que el otro lado se deja sin marcar como referencia (izquierda). Los nombres de las suturas están codificados por colores en consecuencia (derecha). (B) Huesos del cráneo codificados por colores. Los huesos están codificados por colores en un lado del cráneo, mientras que el otro lado se deja sin marcar como referencia (izquierda). Los nombres de los huesos están codificados por colores en consecuencia (derecha). (C) Sección transversal de la parte central del OE (diseccionada usando el método descrito en este artículo) con cornetes codificados por colores en un lado y la parte superior izquierda sin marcar como referencia (izquierda). Nombres de los cornetes visualizados (derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 ml</td><td>Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>Pinza para huesos&nbsp;</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>16102-11</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris miniatura Bonn&nbsp;</td><td>Miltex&nbsp;</td><td>18-1392</td><td></td></tr><tr><td>Solución de albúmina de suero bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #3</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>Ratones hembra C57BL/6J</td><td>El laboratorio Jackson</td><td>JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Tubos en C de gentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>disociador de octo gentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Filtros inteligentes MACS 30 mmm</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>Filtros inteligentes MACS 70 mmm</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Micro Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>16220-14</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de extracción de núcleos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-128-024</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x sin calcio ni magnesio, PH 7,4 &plusmn; 0.1</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor protector de la ARNasa</td><td>Millipore Sigma</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Scientific</td><td>50119927-5</td><td></td></tr></tbody></table>

disección y disociación rápidas del epitelio olfativo de ratón para suspensiones de un solo núcleo

Rapid Dissection and Dissociation of the Mouse Olfactory Epithelium for Single-Nucleus Suspensions

Para proporcionar un contexto anatómico para la disección y el análisis, se visualizaron y codificaron por colores las suturas y los huesos del cráneo del ratón C57BL/6, así como la porción central del epitelio olfatorio (OE) (Figura 1). Un lado de cada imagen se anotó para resaltar las suturas, huesos y cornetes relevantes, mientras que el otro lado se dejó sin marcar como referencia. La sección transversal de OE se preparó siguiendo los protocolos establecidos20, y ...

Disección y disociación rápidas del epitelio olfativo de ratón para suspensiones de un solo núcleo

The murine olfactory epithelium is the initial entry point of the olfactory system, housing various cell types that include olfactory sensory neurons, ...

rapid-dissection-dissociation-mouse-olfactory-epithelium-for-single

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fotólisis de compuestos enjaulados permite la producción de aumentos rápidos y localizados en la concentración de diversos compuestos fisiológicamente activos. Aquí, se muestra cómo obtener el patch-clamp grabaciones en combinación con la fotólisis de AMPc jaula o jaulas Ca para el estudio de la transducción olfativa en disociada del ratón neuronas sensoriales olfativas.

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

El video muestra el aislamiento de neuronas oculomotoras, trocleares y motoras espinales de un embrión de ratón transgénico. El embrión expresa neuronas motoras marcadas con una proteína verde fluorescente (GFP) para una fácil visualización e identificación. Las neuronas motoras se aíslan quirúrgicamente bajo un microscopio de fluorescencia y se mantienen en un medio de cultivo.

Aislamiento y cultivo de neuronas motoras oculomotoras, trocleares y espinales de un embrión de ratón

Este video muestra un método para aislar células primarias de oligodendrocitos de una suspensión de células neuronales obtenida de una cría de ratón utilizando separación magnética. La técnica emplea perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos específicos contra los antígenos de los oligodendrocitos, lo que permite el aislamiento selectivo de estas células.

Aislamiento de oligodendrocitos primarios murinos mediante perlas inmunomagnéticas

Este video muestra el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales olfativas (OSN) en ratones utilizando una técnica de patch-clamp perforada. El epitelio olfativo, que contiene OSN con receptores de olor marcados con fluoróforos, se aísla de un ratón y se asegura en una cámara de registro. Una pipeta de registro se sujeta a la perilla dendrítica de un OSN, y la nistatina dentro de la pipeta perfora la membrana para formar una conectividad eléctrica con la célula. Por último, se...

Registro de neuronas sensoriales olfativas en ratones

Los cilios de las neuronas sensoriales olfativas contienen proteínas de la cascada de transducción de señales, pero un análisis espacial detallado de su distribución es difícil en las criosecciones. Describimos aquí un enfoque optimizado para el marcaje de montaje completo y la visualización en la cara de las proteínas ciliares.

Todo el montaje de etiquetado de los cilios en el sistema olfativo principal de ratones

El análisis de las propiedades fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas aún enfrenta limitaciones técnicas. Aquí los registramos a través de una pinza de parche perforada en una preparación intacta del epitelio olfativo en ratones dirigidos a genes. Esta técnica permite la caracterización de las propiedades de la membrana y las respuestas a ligandos específicos de neuronas que expresan receptores olfativos definidos.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Los oligodendrocitos son las células mielinizantes del sistema nervioso central. Este protocolo describe un método para el aislamiento y cultivo de sus precursores, células progenitoras de oligodendrocitos, a partir de cortezas de rata, así como un método cuantitativo rápido y fiable para evaluar la oligodendrogénesis in vitro en respuesta a factores experimentales.

Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

Describimos el aislamiento Inmunomagnética de los oligodendrocitos primario de ratón, que permite el aislamiento rápido y específico de las células para el cultivo en vitro .

Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

Se presenta un método para la microdisección del oviducto de ratón que permite la recolección de los segmentos individuales mientras se mantiene la integridad del ARN. Además, se describe el procedimiento de disociación de células oviductales no enzimáticas. Los métodos son apropiados para el posterior análisis de genes y proteínas de los segmentos oviductales funcionalmente diferentes y las células oviductales disociadas.

Microdisección y disociación del oviducto murino: identificación de segmentos individuales y aislamiento unicelular

El éxito de la transcriptómica y multiómica de una sola célula/núcleo único depende en gran medida de la calidad de las células/núcleos. Por lo tanto, el aislamiento de células/núcleos de los tejidos y su purificación debe estar altamente estandarizado. Este protocolo describe la preparación de núcleos del cerebro y la médula ósea para el ensayo multioma de un solo núcleo aguas abajo.

Preparación de núcleos cerebrales y de médula ósea de alta calidad para ensayos multioma de núcleos individuales

Aprende a diseccionar y disociar rápidamente el epitelio olfativo de ratón para secuenciación de ARN de núcleo único. Este protocolo facilita estudios genómicos del sistema olfativo con alta calidad.

Disección y disociación rápidas del epitelio olfativo de ratón para suspensiones de un solo núcleo

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