Un protocolo basado en fluorescencia para el cribado preliminar de inhibidores de síntesis de proteínas de fuentes naturales

Un protocolo basado en fluorescencia para el cribado preliminar de inhibidores de síntesis proteica de fuentes naturales. La síntesis de proteínas implica procesos altamente regulados, transcripción y traducción. La transcripción está regulada principalmente por factores de transcripción, modificaciones de la cromatina y ARN reguladores.

Mientras que la traducción está regulada por factores de iniciación, vías de señalización y mecanismos de estabilidad del ARN. Estos sistemas reguladores permiten a las células mantener las funciones celulares y responder eficazmente al estrés o daños. Las células cancerosas desregulan la síntesis de proteínas al secuestrar la maquinaria traslacional para soportar sus altas demandas energéticas y crecimiento descontrolado.

Esta reprogramación es resultado de la desregulación de casi todas las principales vías de señalización oncogénica, promoviendo la supervivencia, proliferación y metástasis celular, mientras suprime las vías de muerte celular. Dado que esta síntesis proteica mejorada es crucial para la supervivencia del cáncer, los tratamientos que atacan y bloquean este proceso muestran potencial como terapias potenciales. Para identificar inhibidores de síntesis de proteínas, se puede utilizar el siguiente ensayo de fluorescencia por inhibición de la síntesis proteica.

Antes de iniciar el experimento, para obtener resultados fiables, los compuestos deben administrarse en una concentración adecuada por debajo de su umbral de toxicidad. Para establecer una concentración inicial, debe realizarse un ensayo de citotoxicidad para determinar la CE 50 del compuesto. Si esto no es factible, los compuestos de este ensayo pueden probarse de forma dependiente de la dosis para determinar los parámetros de concentración más efectivos.

Si la concentración de los compuestos desencadena la muerte celular, es necesario hacer pruebas a concentraciones reducidas. También es importante proteger los tintes de la luz en todo momento cuando no se usan. La exposición prolongada a la luz provocará un blanqueamiento fotográfico, lo que afecta la calidad de los datos.

Paso 3.1, preparar la mezcla maestra A, etiquetar un tubo centrífugo como A y luego pipetear 598,5 microlitros de medio de cultivo y 1,5 microlitros de marcado proteico en A. Resuspender esta mezcla para asegurar la homogeneidad pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Ahora prepara la mezcla maestra B. Etiqueta un tubo de centrífuga como B, luego pipeta 1,5 microlitros de etiqueta proteica, 6,6 microlitros de cicloheximida y 591,9 microlitros de medio de cultivo en B. Resuspende esta mezcla para asegurar la homogeneidad pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Después de pipetear un microlitro de compuesto de prueba y un microlitro de vehículo en dos pozos, pipetear suavemente 99 microlitros de mezcla maestra A en ambos pozos, pipeteando en ángulo hacia el lateral del pozo para evitar la interrupción cinética de las células.

Pipetear 100 microlitros de mezcla maestra B en dos pozos sin tratar. Pipetear en ángulo hacia el lateral del pozo para evitar la interrupción cinética de las células. Golpea suavemente la placa para lograr la incorporación completa de los componentes deseados dentro de las células.

Incubar las células a 37 grados Celsius durante 30 minutos a dos horas. Retira el medio de cultivo celular mediante aspiración. Inclina la placa y aspira en el lateral del pozo en lugar del centro para evitar la alteración cinética de las células.

Luego añade 100 microlitros de buffer PBS en cada pozo y centrifuga la placa a 900g durante cinco minutos. Después de centrifugar, recuerda eliminar el buffer PBS mediante aspiración. Paso cinco, fijación y permeabilización.

Añade 100 microlitros de solución fijadora a cada pozo. Luego incuba las células a temperatura ambiente durante 15 minutos en un ambiente oscuro. Luego aspira las células.

Lava las células con 100 microlitros de tampón de lavado y retira mediante aspiración. Repite esto dos veces. Añade 100 microlitros de buffer de permeabilización a cada pozo.

Después de esto, incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Elimina el buffer de permeabilización mediante aspiración. Paso seis, reacción y tinción de proteínas.

Prepara la mezcla maestra de cóctel de reacción. Añade 651 microlitros de buffer PBS a un tubo de centrífuga. Luego añade siete microlitros de reactivo de cobre 100x.

Luego siete microlitros de azida fluorescente. Y finalmente, añade 35 microlitros de agente reductor al tubo de la centrífuga. Sigue este orden exacto al añadir los reactivos y luego añade 100 microlitros del cóctel de reacción a cada pozo.

Incuba las células durante 30 minutos en un ambiente oscuro a temperatura ambiente para evitar el blanqueamiento fotográfico. Centrifuga las pilas a 900g durante cinco minutos. Aspira, lava las células y luego aspira de nuevo.

Prepara una dilución 1x de la tinción total de ADN y añade 100 microlitros a cada pozo. Incubar las células a temperatura ambiente durante 20 minutos en un ambiente oscuro para evitar el fotoblanqueamiento. Centrifuga la placa a 900g durante cinco minutos.

Lava las células con 100 microlitros de tampón de lavado y retira por aspiración. Repite este paso dos veces. Finalmente, resuspende las células con 100 microlitros de buffer PBS frío para prepararlas para la imagen.

Paso ocho, la imagen. Introduce la placa en el lector de placas y ajusta la ampliación a 20x. Analizar la tinción del núcleo con el canal GFP de 469/525 nanómetros.

Utiliza auto-flexión y autoenfoque para mejorar los resultados de imagen. Analizar la síntesis activa de proteínas con el canal Texas Red 586/647 nanómetros. Utiliza auto-flexión y autoenfoque para mejorar los resultados de imagen.

Las sondas fluorescentes son sensibles al fotoblanqueo, que es un fenómeno en el que una radiación con luz hace que los fluoróforos pierdan sus propiedades fluorescentes. Los tintes deben estar protegidos de la luz en todo momento cuando no se usan. Además, es necesario limitar el número de escaneos dentro de cada pozo y el tiempo bajo luz irradiada.

La exposición prolongada a la luz provocará un fotoblanqueamiento, lo que finalmente lleva a una calidad de datos comprometida. Veamos los resultados representativos. Las células vivas aquí se observan en verde y la síntesis activa de proteínas se indica en rojo.

El inhibidor conocido de la síntesis de proteínas, la cicloheximida, provoca una gran disminución en la síntesis proteica, como se ve en la figura 1B en comparación con el DMSO de control negativo en la figura 1A, donde se emite menos luz fluorescente roja. El tratamiento con compuesto uno, como se ve en la figura 1C, resultó en desprendimiento celular o muerte celular. Por tanto, no podemos hacer afirmaciones definitivas sobre su actividad de inhibición de la síntesis de proteínas.

Esto requiere más estudios de respuesta a la dosis para intentar determinar si inhibe la síntesis de proteínas a concentraciones más bajas. El compuesto dos muestra una inhibición moderada de la síntesis de proteínas, como se indica en la figura 1D. Este ensayo fluorométrico es una herramienta de investigación valiosa y un método accesible de biología química para formar a estudiantes de grado.

Al proporcionar un protocolo accesible y eficiente con un procesamiento mínimo de datos, proporciona a los estudiantes experiencia práctica y técnicas modernas de descubrimiento de fármacos, y acelera el proceso de descubrimiento. El protocolo emplea un sustrato fluorescente y técnicas avanzadas de microscopía fluorescente para detectar y medir sistemáticamente las capacidades inhibitorias de los compuestos de producto natural uno y dos. Utilizando la cicloheximida como inhibidor de referencia, ambos productos naturales mostraron distintos niveles de inhibición de la síntesis proteica.

A medida que crece la demanda de nuevos inhibidores de síntesis proteica, este enfoque dota a los estudiantes de grado de oportunidades significativas de investigación, al tiempo que contribuye a los avances en la terapéutica contra el cáncer.