Cuantificación de violaceína en Chromobacterium violaceum y su inhibición por compuestos bioactivos

Nuestra investigación tiene como objetivo identificar compuestos que inhiban la detección de quórum, que regula fenotipos clave. Este protocolo examina las moléculas que reducen la producción de violaceína sin afectar el crecimiento bacteriano, lo que sugiere una interferencia de detección de quórum. Estudios recientes han identificado nuevos compuestos bioactivos que inhiben la detección de quórum sin afectar el crecimiento bacteriano, reforzando su potencial como agentes antivirulencia contra bacterias resistentes a los antibióticos.

Los principales desafíos incluyen la especificidad de la inhibición de la detección de quórum, ya que los compuestos pueden afectar el crecimiento o los rasgos. En este protocolo llamado deferencia y solubilidad, la cuantificación del equilibrio de impacto requiere un manejo cuidadoso. Establecimos un protocolo utilizado en compuestos bioactivos a concentraciones subinhibitorias que no afectan el crecimiento bacteriano.

Esta es una premisa clave para iniciar la señalización de detección de quórum diferente de la investigación antimicrobiana. Nos centraremos en identificar nuevos inhibidores del estado del quórum y mecanismos de inhibición dilucidados de la comunicación, especialmente en bacterias relevantes para la alimentación y la salud. Para comenzar, cultive un cultivo de cinco mililitros de chromobacterium violaceum ATCC 12472 en caldo Luria Bertani o LB.

Incube el cultivo a 30 grados centígrados en una incubadora agitadora a 220 revoluciones por minuto durante 24 horas. Mida la densidad óptica del cultivo nocturno y ajústela a aproximadamente uno por 10 a la potencia de ocho unidades formadoras de colonias por mililitro. Usando el caldo LB.

Para la preparación del compuesto, pesar el compuesto bioactivo y diluirlo en DMSO puro o en una mezcla uno a uno de DMSO y agua, dependiendo de la solubilidad. Tome una placa de fondo plano de 96 pocillos y agregue caldo LB junto con el compuesto bioactivo de acuerdo con un esquema de dilución en serie. Para calcular el volumen requerido de solución madre para la concentración deseada en cada pocillo aplique la fórmula.

En la primera columna de cada juego de dilución de cereales. Agregue 196 microlitros de caldo Luria Bertani a las columnas tres, cinco y siete. Luego, en las columnas posteriores utilizadas para la dilución, agregue 100 microlitros de caldo Luria Bertani a las columnas cuatro, seis y ocho.

Para iniciar la dilución en serie, agregue cuatro microlitros del compuesto bioactivo al primer pocillo de cada conjunto, que corresponde a las columnas tres, cinco y siete. Después de mezclar, transfiera 100 microlitros de cada pocillo a la columna adyacente. Para continuar la dilución en serie llegando a las columnas cuatro, seis y ocho.

Repita todo el procedimiento por triplicado para cada concentración de cada compuesto utilizando puntas nuevas para evitar la contaminación cruzada. Agregue 80 microlitros de caldo Luria Bertani a las filas B a D en todos los pocillos. Llevando el total a 180 microlitros por pozo.

Luego agregue 20 microlitros del cultivo estandarizado de chromobacterium violaceum de la preparación anterior a cada uno de esos pocillos, alcanzando un volumen final de 200 microlitros. Basado en la compatibilidad del espectrofotómetro. Cubra la microplaca con una tapa o una película de sellado para evitar la evaporación.

Incube la placa sellada a 30 grados centígrados con agitación a 130 revoluciones por minuto durante 24 horas. Después de la incubación, transfiera la placa a una incubadora de secado a 60 grados centígrados. Retire la tapa y deje que se seque por completo durante aproximadamente ocho horas.

Una vez seco, retire la placa de la incubadora y agregue 200 microlitros de DMSO puro a cada pocillo. Cubra la placa e incube a 25 grados centígrados agitando a 130 revoluciones por minuto durante 30 minutos para disolver el pigmento de violaceína. Después de la incubación, transfiera cuidadosamente 100 microlitros de la solución de violaceína disuelta a una nueva microplaca.

Evitar el contacto entre la punta de la pipeta y las paredes del pocillo. Mida la absorbancia de la violaceína a 595 nanómetros en un espectrofotómetro de microplacas con la tapa puesta para evitar la contaminación. Agite durante cinco segundos antes de cada lectura y realice la lectura con la tapa puesta para evitar la contaminación.

Para calcular la producción de violaceína, primero reste la absorbancia del blanco de cada muestra para excluir la interferencia de fondo y luego calcule el porcentaje de violaceína utilizando el control no tratado como referencia con la ecuación. Se probaron tres compuestos bioactivos, resveratrol, farnesol y linalool por su capacidad para inhibir la producción de violaceína en chromobacterium violaceum ATCC 12472. Farnesol redujo significativamente la producción de violaceína al 9% a 200 microgramos por mililitro y al 19% a 100 microgramos por mililitro, en comparación con el 100% en el control no tratado.

El tratamiento con linalool a 200 y 100 microgramos por mililitro dio como resultado una producción de violaceína del 32%, mostrando una inhibición del 68% en relación con el control. El resveratrol a 25 microgramos por mililitro redujo la producción de violaceína al 15%, mientras que a 12 microgramos por mililitro, alcanzó el 30% en comparación con el 100% en el control no tratado. Las imágenes en microplaca confirmaron visualmente la reducción de la pigmentación de violaceína para todos los tratamientos en comparación con el control no tratado.