Análisis conductual de la disfunción locomotora en Drosophila melanogaster como lectura de la neurotoxicidad

El objetivo de nuestra investigación es desarrollar un método altamente rentable y ético para la detección de compuestos neurotóxicos. Los métodos tradicionales de pruebas de toxicología a menudo se basan en modelos de tarifas virtuales, que son costosos, consumen mucho tiempo y, por lo demás, son preocupaciones éticas, como sabemos. Queríamos explorar si podíamos detectar signos tempranos de neurotoxicidad utilizando un modelo alternativo como Drosophila melanogaster que es sensible y escalable. Este protocolo nos ayuda a detectar fenotipos de comportamiento como alteraciones en los patrones de movimiento e hiperactividad, pero también deterioro motor progresivo o interrupciones escritas de seguridad, y también se prueba la amplia preferencia.

Lo que hace que nuestro protocolo sea una ventaja es que combina el ensayo de escalada clásico con una tecnología de monitoreo en tiempo real, y esto nos permite capturar deficiencias motoras sutiles que podrían pasarse por alto. Por métodos tradicionales que proporcionan una mayor sensibilidad y datos de comportamiento más precisos.

[Narrador] Para comenzar, transfiera suavemente las moscas a una botella vacía. Coloque la botella que contiene las moscas dentro de una caja llena de hielo, asegurándose de que toda la botella esté cubierta. Después de un minuto, golpee suavemente la botella para verificar que todas las moscas estén anestesiadas. Prepare un recipiente más pequeño lleno de hielo. Coloque una placa de Petri o una superficie plana y limpia sobre el hielo para crear una plataforma fría. Ahora invierta el tubo sobre la placa de Petri fría y golpee suavemente para liberar las moscas sobre la superficie fría. Transfiera con cuidado las moscas a viales vacíos. Deje que las moscas se recuperen de la anestesia durante 30 minutos en un ambiente controlado a 25 grados Celsius con un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas y 50% de humedad. A continuación, para la preparación de alimentos microcapilares, use una pipeta para cargar manualmente 10 microlitros de la solución de prueba en cada tubo microcapilar, asegurando un volumen constante en todas las muestras. Agregue de tres a cinco microlitros de aceite mineral al extremo abierto de cada tubo microcapilar para evitar la evaporación y las fugas durante el experimento. Inserte los microcapilares precargados a través de los orificios en los tapones de los viales de algodón, asegurando un ajuste seguro. Coloque los viales que contienen moscas en una incubadora a 25 grados Celsius con un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, y deje los viales en la incubadora durante la duración del experimento. Cada 12 horas, transfiera las moscas a un vial limpio y vacío para evaluar su actividad locomotora. Mida y marque la línea a siete centímetros del fondo del frasco con un marcador permanente. Esta marca servirá como objetivo de escalada. Coloque una cámara o un teléfono en un lugar estable para registrar el comportamiento de escalada. Garantice una iluminación adecuada y un fondo transparente para permitir una visibilidad y un análisis claros. Confirme que la configuración experimental es compatible con el campo de visión de la cámara y comience a grabar. Revise las grabaciones de video y mida el tiempo que tarda cada mosca en alcanzar la marca de siete centímetros. Prepare los microcapilares de alimentación con la muestra y el sello de aceite mineral como se muestra anteriormente. Luego prepare cámaras de locomoción individuales con pajitas de plástico transparente cortadas a aproximadamente seis centímetros de largo. Selle un extremo de cada pajita con una película transparente para crear un cierre hermético. Cerca del extremo sellado de la pajita, cree un pequeño orificio para insertar el microcapilar de alimentación, asegurándose de que encaje perfectamente y no gotee ni se mueva durante el ensayo. Después de anestesiar y segregar las moscas como se mostró anteriormente, coloque suavemente una mosca anestesiada en cada tubo con un pincel fino. Selle el extremo abierto de cada tubo con una película transparente o un tapón de algodón, permitiendo el flujo de aire y evitando el escape. Ahora inserte un microcapilar precargado en cada cámara preparada a través del orificio designado. Coloque los tubos ensamblados en la arena de ensayo, asegurándose de que los microcapilares permanezcan accesibles para su reemplazo diario. Coloque toda la configuración dentro de una cámara mantenida a 25 grados centígrados con un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas y un 50% de humedad. Conecte el dispositivo al sistema de rastreo local o a la red. Acceda a la plataforma de software y localice el dispositivo asignado al experimento. Asegúrese de que el sistema esté rastreando correctamente cada mosca en función de los marcadores visuales. Ingrese todos los metadatos experimentales y comience a grabar el ensayo. La capacidad de escalada evaluada mediante el ensayo de geotaxis negativa a las 24 y 48 horas muestra un rendimiento similar entre los grupos de control y tratamiento a las 24 horas, lo que indica que no hay déficits motores inmediatos. A las 48 horas, las moscas tratadas tardan casi el doble en trepar en comparación con los controles, lo que refleja un deterioro motor significativo. El seguimiento continuo de la actividad revela que las moscas tratadas inicialmente muestran un mayor movimiento, pero su actividad disminuye drásticamente después de 12 horas, lo que sugiere una hiperexcitabilidad temprana seguida de una función motora reducida. A las 24 a 40 horas, las moscas tratadas muestran un movimiento reducido en comparación con los controles. En general, las moscas tratadas tienen una actividad reducida de aproximadamente un 20% durante 40 horas. Las moscas tratadas respondieron inicialmente con un retraso en las señales de luz seguido de una alineación circadiana transitoria, pero perdieron progresivamente la ritmicidad a las 48 horas, probablemente como resultado del déficit locomotor. Las moscas tratadas prefieren las zonas de luz más que los controles.