In vitro Reconstitución de redes citoesqueléticas dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUV) separadas en fase

Nuestra investigación explora si una célula sintética mínima puede replicar funciones biológicas clave, centrándose en el diseño de membranas que imiten de cerca la estructura y el comportamiento de las membranas celulares naturales.

Se emplean diferentes tecnologías para fabricar vesículas separadas por fases y utilizar estos microportadores para una variedad de aplicaciones. Las tecnologías, por ejemplo, son cDICE de doble capa y electroformación. Un desafío importante es mantener la funcionalidad de las proteínas mientras se genera la separación de fases en la vesícula de la membrana. El aumento de la temperatura puede desestabilizar las proteínas y otras biomoléculas.

[Narrador] Para comenzar, obtenga viales de mezclas de lípidos biotinilados y no biotinilados. Disuelva 50 microlitros de cada mezcla de lípidos de 32 milimolares en cloroformo. Luego, séquelos en dos viales de vidrio bajo flujo de gas nitrógeno durante aproximadamente 15 minutos. Coloque los viales de vidrio en un desecador. Guárdelos al vacío durante aproximadamente 30 minutos para eliminar cualquier cloroformo residual. Ahora, disperse las películas lipídicas secas en una mezcla de 20 microlitros de decano y 500 microlitros de aceite mineral en los mismos viales para lograr una concentración final de lípidos de 3,2 milimolares. Con un sonicador de baño, sonique las dos mezclas a aproximadamente 50 grados centígrados durante 30 minutos. Luego, transfiera las mezclas de lípidos y aceite a dos tubos. Mientras se incuban las mezclas, prepare la mezcla de encapsulación interna para las proteínas. Para preparar la mezcla de proteínas FtsZ, agregue los reactivos enumerados hasta un volumen final de 10 microlitros en un tubo. Mantenga la mezcla en hielo hasta su uso. Para la encapsulación de haces de actina, primero prepare 10 microlitros de la mezcla maestra de actina, que contiene 86% de G-actina, 10% de actina ATTO 488 y 4% de actina biotinilada en agua. Mantenga la mezcla en hielo y protéjala de la luz. Justo antes de su uso, prepare la solución final de actina añadiendo, en orden, yodixanol, agua, NeutrAvidin, BSA, Ficoll 70, tampón de polimerización de actina 10x, A-Mix, fajina y ATP. Mezclar bien y usar cinco microlitros para encapsular. Para encapsular FtsZ, pipetee 500 microlitros de tampón de reacción FtsZ en un tubo de plástico de 1,5 mililitros. Agregue suavemente 200 microlitros de mezcla de lípidos y aceite para formar una interfaz aceite-agua. En un segundo tubo, agregue 200 microlitros de mezcla de lípidos y aceite. Incube este tubo a 37 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, pipetee cinco microlitros de la mezcla de proteínas FtsZ en el tubo de lípidos y aceite incubado, permitiendo que se hunda en forma de gota. Golpee suavemente el tubo de cinco a seis veces, hasta que la solución se vuelva turbia, para formar una emulsión. Pipetee con cuidado esta emulsión sobre la interfaz aceite-agua preparada anteriormente. A continuación, centrifugar la muestra a 6.000 g durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Enfríe la muestra a temperatura ambiente durante 30 minutos. Ahora, use una pipeta para eliminar suavemente la capa superior de aceite, dejando de 100 a 200 microlitros de solución para obtener imágenes. Corta la punta de una pipeta en ángulo. Úselo para recuperar de 50 a 100 microlitros de solución GUV del fondo del tubo. Para encapsular la actina directamente en una placa de 96 pocillos, combine 198 microlitros de glucosa de dos molares con 802 microlitros de agua para preparar una solución de glucosa externa que coincida con la osmolaridad de la mezcla de actina interna. Pasivar un pocillo de una placa de 96 pocillos agregando 100 microlitros de BSA de 10 gramos por litro a un pocillo. Después de una incubación de 10 a 15 minutos, lave el pocillo cinco veces con 100 microlitros de solución externa. Deja 100 microlitros del lavado final. Ahora, agregue suavemente 50 microlitros de mezcla de lípidos y aceite al pocillo apoyando la pipeta en la pared lateral para asegurar una correcta estratificación sobre la solución exterior. En un tubo aparte, agregue 100 microlitros de lípidos en aceite e incube. Agregue 2,5 microlitros de solución final de actina al tubo de lípidos y aceite incubado, permitiendo que se hunda en forma de gota. Golpee suavemente el fondo del tubo de 10 a 20 veces, hasta que la mezcla se vuelva turbia. Pipetee suavemente la emulsión en el centro de la monocapa de aceite en el pozo, sin romper la interfaz. Luego, centrifugue la placa de 96 pocillos a 200 g durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Deje que la placa se enfríe a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de obtener imágenes. Se obtuvieron vesículas unilamelares gigantes, o GUV, con membranas desmezcladas en dominios desordenados y ordenados en líquido, y un alto rendimiento de vesículas de entre cinco y 30 micrómetros. Las redes FtsZ se recapitularon dentro de los GUV y se localizaron preferentemente en los dominios de membrana desordenados por líquidos en presencia de GTP y Ficoll 70. Las redes de actina, cuando se reconstituían, aparecían como haces delgados que se adherían a la membrana y formaban estructuras dispersas en forma de red. Sin lípidos biotinilados, los haces de actina no se adhirieron a la membrana y, en cambio, permanecieron rígidos y rectos dentro de la luz de la vesícula. En condiciones de centrifugación más altas, las vesículas que contienen actina miosina se agregan en una arquitectura similar a un tejido empaquetado en el pozo de producción.