Name: In vitro Reconstitución de redes citoesqueléticas dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUV) separadas en fase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Aprende a reconstituir redes citoesqueléticas dentro de vesículas unilamelares gigantes separadas en fase. Este método permite encapsular proteínas como FtsZ y actina para estudiar la dinámica celular.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal de sodio) (DOPG)</td><td>Lípidos polares de Avanti</td><td>840475</td><td>en cloroformo</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)</td><td>Lípidos polares de Avanti</td><td>850375</td><td>en cloroformo</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(tapa biotinil) (sal de sodio) (18:1 Biotinyl Cap PE)</td><td>Lípidos polares de Avanti</td><td>870273</td><td>en cloroformo</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal de sodio) (DPPG)</td><td>Lípidos polares de Avanti</td><td>840455</td><td>En cloroformo</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)</td><td>Lípidos polares de Avanti</td><td>850355</td><td>En</td></tr><tr><td>microplaca de fondo plano de 96 pocillos de cloroformo (SensoPlate)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Actina (músculo esquelético alfa-actina, conejo)</td><td>HYPERMOL</td><td>8101-01</td><td></td></tr><tr><td>Atto488-Actin (músculo esquelético alfa-actina, conejo)</td><td>HYPERMOL</td><td>8153-01</td><td></td></tr><tr><td>Atto655-DOPE</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 655-16</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador de baño</td> de polvo <td>Branson&nbsp;</td><td>1510R-MTH</td><td>Limpiador ultrasónico Bransonic</td></tr><tr><td>Biotina-Actina (alfa-actina músculo esquelético, conejo)</td><td>HYPERMOL</td><td>8109-01</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol (ovino)</td><td>Avanti Lípidos polares</td><td>700000</td><td>En cloroformo</td></tr><tr><td>Decane</td><td>TCI Deutschland GmbH</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>Fascina (humana, recombinante)</td><td>Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)</td><td>CS-FSC01-A</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll70</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2878</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol (OptiPrep)</td>Láser confocal <td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>LSM800 microscopio de barrido</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>C-Apochromat 40&thinsp; &tiempos; Objetivo de inmersión en agua. Láseres de estado sólido bombeados por diodos: 488&thinsp; nm y 640&thinsp; Nm.</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>Miosina II (músculo esquelético de conejo)</td><td>Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)</td><td>MY02-A</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidina</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>Osmómetro <td>31000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fiske Associates</td><td></td><td>Micro-Osmómetro Fiske modelo 120</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One</td><td>&nbsp; GmbH</td><td>07-000-109</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitución de redes citoesqueléticas dentro de vesículas unilamelares gigantes (guv) separadas en fase

In vitro Reconstitution of Cytoskeletal Networks inside Phase Separated Giant Unilamellar Vesicles (GUVs)

Como primer paso, se produjeron GUVs con separación de fases por membrana siguiendo un enfoque de emulsión invertida modificada (Figura 1A). Esto da como resultado un alto rendimiento de GUVs, que exhiben una membrana desmezclada en dominios Ld y Lo , como lo representa la etiqueta Atto 655-DOPE en el dominio Ld y las regiones oscuras correspondientes a los dominios Lo no marcados (Figura 1B). Este método produce GUV separados por fases de tamaños que oscilan entre 5 y 30 μm (Figura 1C) a temperaturas elevadas (todos los pasos se realizan a 37 °C y se obtienen imágenes en RT). Además, se ajustaron las velocidades de centrifugación para asegurar la incorporación de los lípidos componentes originales dentro de los GUV, así como para evitar una sobrepoblación excesiva.
Además, para demostrar la encapsulación exitosa de biomoléculas utilizando el método de emulsión descrito en el protocolo actual, tanto las redes de FtsZ como las de actina se reconstituyeron en experimentos individuales. Las redes FtsZ se recapitulan dentro de GUVs, que emergen como filamentos que se unen preferentemente a los dominios Ld a través de su secuencia de membrana dirigida (MTS) en presencia de 2,5 mM GTP y 50 g/L Ficoll70 (como se muestra en la Figura 2). Las redes se observaron aproximadamente 1 h después de la etapa de encapsulación. Sin embargo, las redes de actomiosina emergen como haces delgados (en contraste con las redes gruesas de FtsZ) después de la reconstitución dentro de los GUV (Figura 3). Hay que tener en cuenta que los lípidos biotinilados desempeñan un papel crucial en la unión de las redes de actomiosina a la membrana de los GUV. Sin lípidos biotinilados, los haces de actomiosina no pueden adoptar una configuración curva y permanecen como haces rectos, cortos y rígidos en la luz en lugar de adherirse a la membrana como una malla enredada de haces largos (Figura 4).
En el protocolo de emulsión modificada, la velocidad de centrifugación se ajusta para obtener GUV separados por fase, como se mencionó anteriormente. De hecho, las velocidades de centrifugación más altas con muestras que contienen redes de actomiosina (600 x g durante 15 min) dan como resultado la agregación de vesículas en una configuración similar a un tejido dentro del pocillo de producción. Por lo tanto, en todos los experimentos de reconstitución estándar de redes de actomiosina, la velocidad óptima de centrifugación se estableció en 200 x g para obtener GUV no agregados (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig1.jpg"> 
Figura 1: Generación de GUV separados en fase en un solo recipiente empleando el método de transferencia de doble emulsión. (A) Esquema experimental de los pasos clave en la producción de vesículas separadas en fase mediante transferencia de doble emulsión. (B) Imagen confocal de proyección Z de los GUV resultantes generada siguiendo el método descrito en A. La barra de escala es de 50 μm. (C) Gráfico de barras con la fracción de GUV separadas en fase generadas según su diámetro. Experimentos realizados n = 3, el número total de GUVs analizados por experimento = 100. Los datos se muestran como valores medios, los puntos de datos individuales son los tres experimentos independientes. Las barras de error representan la desviación estándar de los tres experimentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig2.jpg"> 
Figura 2: Vesículas separadas en fase con redes FtsZ encapsuladas. (A) Imágenes de proyección 3D confocales realizadas en una pila z completamente adquirida de un GUV separado en fase que contiene una red FtsZ. (B) Imágenes de proyección Z confocal realizadas solo en la mitad superior de la vesícula. Debido a la formación heterogénea de dominios sobre la superficie del GUV, la reconstrucción 3D de los cortes confocales adquiridos muestra la superposición de dominios lipídicos de las áreas superior e inferior de la vesícula. Para evitar la superposición y facilitar la inspección visual de los dominios, la mitad inferior de las pilas z adquiridas se eliminan del archivo. La mitad superior resultante se utiliza para su proyección 3D a través de la desviación estándar. Las barras de escala son de 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig3.jpg"> 
Figura 3: Vesículas separadas en fase con redes de actomiosina encapsuladas. (A) Imágenes de proyección Z confocal de una pila completa adquirida con una vista alejada del pocillo después de la producción de vesículas. El alto rendimiento de vesículas obtenido permite el estudio de diferentes estructuras de actomiosina dentro de las vesículas. La barra de escala es de 50 μm. (B) Imágenes confocales de proyección Z realizadas en la mitad superior de una vesícula. Para facilitar el análisis visual de los dominios lipídicos, solo se utiliza la mitad superior de los cortes de imagen para realizar una proyección 3D. La barra de escala es de 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig4.jpg"> 
Figura 4: Importancia de los lípidos biotinilados para la generación de redes de actomiosina unidas a la membrana dentro de vesículas separadas en fase. Proyecciones confocales en 3D que representan vesículas separadas por fase con redes de actomiosina no unidas. Si los lípidos biotinilados no se incorporan a la mezcla, se forman estructuras de actomiosina en el lumen y no adquieren una configuración curva en la valva interna de las vesículas (panel derecho, actina marcada con Atto488). La barra de escala es de 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig5.jpg"> 
Figura 5: Efecto de la velocidad de centrifugación en la producción de vesículas separadas en fase mediante transferencia de emulsión. Imágenes confocales en 2D que muestran una muestra de GUV generada empleando una fuerza de centrifugación de 600 x g durante 15 min. La velocidad de centrifugación empleada, superior a la optimizada de 200 x g, da como resultado la agregación de vesículas en una configuración similar a un tejido dentro del pocillo. La barra de escala es de 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

In vitro Reconstitución de redes citoesqueléticas dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUV) separadas en fase

Biomimetic lipid membranes in the form of giant unilamellar vesicles (GUVs) are commonly used to mimic cellular membrane behavior because of the ease of ...

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Investigación

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