Detección metabólica en tiempo real en células vivas mediante RMN hiperpolarizada ^{de 13}C

Desarrollamos un método no invasivo para medir el metabolismo sérico en tiempo real utilizando técnicas avanzadas de RMN hiperpolarizada. Nuestro objetivo es crear herramientas accesibles para diversas aplicaciones de investigación biológica. Se han descrito varios sistemas de RMN hiperpolarizados para el metabolismo sérico. Sin embargo, hasta ahora no se disponía de protocolos estandarizados y reproducibles para una implementación más amplia de la investigación.

Nuestro protocolo mejora la accesibilidad utilizando componentes comerciales disponibles. También proporcionamos una validación integral, incluidas las ventajas de la mezcla en el sistema y las capacidades de medición repetida para una adaptación más amplia. Nuestros resultados permiten el seguimiento en tiempo real de los cambios metabólicos dinámicos en las células vivas sin distracciones. Esto abre nuevas posibilidades para estudios de fármacos a largo plazo en diversas aplicaciones de sondas metabólicas.

Nuestro enfoque tiene limitaciones, incluidas las opciones de prob y los requisitos de automatización. Resolver los desafíos establecerá técnicas de medición metabólica celular y enriquecerá los esfuerzos de investigación de DNP de nuestro laboratorio en el futuro.

[Narrador] Para comenzar, agregue dos mililitros de solución de tripsina EDTA al 0,25% de volumen a volumen a un plato de 10 centímetros. Incline el plato suavemente para asegurarse de que toda la superficie esté cubierta. Luego aspire el exceso de solución de ácido etilendiaminotracético de tripsina. Coloque el plato en una incubadora a 37 grados centígrados e incube durante dos minutos. Luego agregue 10 mililitros de medio de cultivo al plato. Con una pipeta, pipetea suavemente hacia arriba y hacia abajo para separar las células de la superficie y recoge toda la suspensión celular en un tubo cónico de 15 mililitros. Ahora tome aproximadamente 10 microlitros de la suspensión celular y cárguela en un contador de celdas para determinar el número de células. Asegúrese de que el recuento medido confirme un rendimiento de aproximadamente 10 millones de células o ajústelo según sea necesario. Centrifugar la suspensión celular restante a 120 x g durante cinco minutos. Después de la centrifugación, aspire y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo celular resultante en cuatro mililitros de solución de alginato de peso a volumen al 2% y pipetee lentamente para minimizar la formación de burbujas. Ahora agregue 10 mililitros de solución de cloruro de calcio de 50 milimolares a un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Asegure la jeringa a la tapa del tubo de centrífuga que contiene la solución de cloruro de calcio. Extraiga 300 microlitros de la mezcla de alginato celular en una jeringa de 0,5 mililitros equipada con una aguja de calibre tres de 10 milímetros. Luego cierre bien el tubo de la centrífuga con la jeringa fijada a la tapa y coloque el conjunto en la centrífuga para que gire suavemente a 200 x g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante después de la centrifugación y vuelva a suspender el gel resultante en medio de cultivo. A continuación, con una pipeta Pasteur, transfiera el gel encapsulado en células a un tubo de RMN e inserte el accesorio de esponja para garantizar un sellado hermético. Precaliente el depósito medio que contiene óxido de deuterio al 5% de volumen a volumen en un baño de agua a 37 grados Celsius. Comience la circulación a una velocidad de aproximadamente 500 microlitros por hora para estabilizar las condiciones. Inspeccione la configuración para asegurarse de que no haya fugas antes de continuar. Agregue 18 microlitros de ácido pirúvico marcado con carbono 13 a una concentración de 14,2 molares dopados con 25 milimolares OX063 a un vial de muestra. Conecte el vial a la ruta del fluido del sistema polarizador de polarización nuclear dinámica. A continuación, inserte el vial conectado en la unidad de orificio del polarizador nuclear dinámico. Aplique irradiación de microondas a aproximadamente 188 gigahercios con una potencia de 22 milivatios durante 60 a 80 minutos. Utilice el espectrómetro de resonancia magnética nuclear de estado sólido integrado en el sistema de polarización nuclear dinámica para monitorear la intensidad de la señal de carbono 13. Registre los datos de la señal cada cinco minutos utilizando el software de control de sistemas. Ahora disuelva rápidamente la muestra polarizada en 3,2 mililitros de tampón de disolución precalentado a temperatura biológica. Cargue la muestra preparada en un tubo de RMN e inserte el tubo en el espectrómetro. En la consola de RMN, inicie el procedimiento automatizado para realizar el bloqueo, el ajuste, la coincidencia y la cuña con la muestra en su lugar para garantizar una resolución espectral y una estabilidad de señal óptimas. Cargue una secuencia de adquisición de pulsos de carbono 13 con el desacoplamiento de protones habilitado usando una configuración como 13-CPD. Establezca el ángulo de giro en 90 grados con un pulso de un microsegundo etiquetado como P1. A continuación, defina el tiempo de adquisición como 1,376 segundos, el ancho espectral como 23.663 hercios y los puntos de adquisición, o TD, como 65.536. Ajuste el retardo de relajación D1 a cero segundos. Asigne 150 incrementos de tiempo a TD1 para adquirir 150 espectros secuenciales en modo pseudo-2 dimensional, y ajuste la ganancia del receptor a un valor bajo, como aproximadamente uno, para evitar la saturación de la señal causada por las muestras hiperpolarizadas. Ahora detenga la bomba peristáltica para detener temporalmente la circulación del medio antes de inyectar la solución hiperpolarizada a través del tubo de entrada. Comience la adquisición espectral aproximadamente 10 segundos antes de disolver el sustrato hiperpolarizado para garantizar la captura de la señal al llegar al sitio de detección. Cuando la solución salga del polarizador de polarización nuclear dinámica, extraiga un mililitro en una jeringa. Cambie la válvula de tres vías en la entrada del biorreactor a la posición B para dirigir la solución hiperpolarizada hacia el tubo de RMN. Una vez completada la inyección, vuelva a colocar la válvula en la posición A para reanudar la circulación del medio y evitar cualquier reflujo. Finalmente, confirme que la inyección fue exitosa después de notar un aumento en la señal de caída de inducción libre en el software de adquisición. Asegúrese de que la solución final alcance una temperatura entre 308 y 313 Kelvin y un pH de aproximadamente siete antes de transferirla para la medición de RMN. Se adquirieron espectros de RMN de carbono hiperpolarizado 13 de la misma muestra encapsulada en células SCCVII a intervalos de 1,5 horas para evaluar la viabilidad de mediciones repetidas no destructivas. La primera medición de RMN mostró un marcado aumento de la señal de lactato, lo que indica una conversión metabólica activa de piruvato a lactato. Las mediciones posteriores a intervalos de 1,5 horas revelaron una reducción progresiva en la intensidad de la señal de lactato, lo que indica una disminución de la actividad metabólica con el tiempo. En las células HeLa, las mediciones iniciales confirmaron una conversión exitosa de piruvato a lactato con picos de señal claramente discernibles. Aunque la señal disminuyó gradualmente debido a la relajación de T2, la relación señal-ruido se mantuvo adecuada durante la adquisición de 60 segundos, lo que sugiere que el protocolo actual es ampliamente aplicable y puede servir como una herramienta versátil para el perfil metabólico en tiempo real en varios tipos de células.