Name: Detección metabólica en tiempo real en células vivas mediante RMN hiperpolarizada de 13C (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprende a medir el metabolismo del piruvato en células vivas mediante RMN hiperpolarizada de ¹³C en tiempo real. Este protocolo validado mejora la reproducibilidad y precisión cinética para estudios metabólicos y cribado de fármacos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+signal-to-noise+ratio+of+%26gt%3B10%2C000+times+in+liquid-state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Increase in signal-to-noise ratio of &gt;10,000 times in liquid-state NMR.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (18), 10158-10163 (2003).</li>
<li>Comment, A., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+magnetic+resonance+as+a+sensitive+detector+of+metabolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized magnetic resonance as a sensitive detector of metabolic function.</a> Biochemistry. 53 (47), 7333-7357 (2014).</li>
<li>Balzan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolution+Dynamic+Nuclear+Polarization+Instrumentation+for+Real-time+Enzymatic+Reaction+Rate+Measurements+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR.</a> J Vis Exp. (108), e53548(2016).</li>
<li>Liu, M., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+measurements+of+nonpermeating+compounds+in+live+cells+using+hyperpolarized+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic measurements of nonpermeating compounds in live cells using hyperpolarized NMR.</a> Anal Chem. 90 (2), 1217-1222 (2018).</li>
<li>Sannelli, F., Jensen, P. R., Meier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+NMR+approach+for+real-time+exploration+of+pathway+versatility%3A+substrate+mixtures+in+nonengineered+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">In-cell NMR approach for real-time exploration of pathway versatility: substrate mixtures in nonengineered yeast.</a> Anal Chem. 95 (18), 7262-7270 (2023).</li>
<li>Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hyperpolarized+13C1-pyruvate+transport+and+metabolism+in+living+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (43), 18131-18136 (2009).</li>
<li>Rao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%5B1-13C%5Dpyruvate-to-%5B1-13C%5Dlactate+conversion+is+rate-limited+by+monocarboxylate+transporter-1+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized [1-13C]pyruvate-to-[1-13C]lactate conversion is rate-limited by monocarboxylate transporter-1 in the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117 (36), 22378-22389 (2020).</li>
<li>Mathiassen, T. B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+13C+NMR+for+longitudinal+in-cell+metabolism+using+a+mobile+3D+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson+Open%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized 13C NMR for longitudinal in-cell metabolism using a mobile 3D cell culture system.</a> J Magn Reson Open. 16 - 17 (100131), 100131(2023).</li>
<li>Meier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+13C+NMR+reveals+pathway+regulation+in+Lactococcus+lactis+and+metabolic+similarities+and+differences+across+the+tree+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized 13C NMR reveals pathway regulation in Lactococcus lactis and metabolic similarities and differences across the tree of life.</a> Molecules. 29 (17), 4133(2024).</li>
<li>Sriram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacteria-specific+metabolism+using+hyperpolarized+%5B2-13C%5Dpyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of bacteria-specific metabolism using hyperpolarized [2-13C]pyruvate.</a> ACS Infect Dis. 4 (5), 797-805 (2018).</li>
<li>Park, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+sodium+%5B1-13C%5D-glycerate+as+a+probe+for+assessing+glycolysis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized sodium [1-13C]-glycerate as a probe for assessing glycolysis in vivo.</a> J Am Chem Soc. 139 (19), 6629-6634 (2017).</li>
<li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+carbohydrate+metabolism+using+hyperpolarized+13C-labeled+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Probing carbohydrate metabolism using hyperpolarized 13C-labeled molecules.</a> NMR Biomed. 32 (10), e4018(2019).</li>
<li>Bohndiek, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%5B1-13C%5D-ascorbic+and+dehydroascorbic+acid%3A+vitamin+C+as+a+probe+for+imaging+redox+status+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized [1-13C]-ascorbic and dehydroascorbic acid: vitamin C as a probe for imaging redox status in vivo.</a> J Am Chem Soc. 133 (30), 11795-11801 (2011).</li>
<li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+insight+into+in+vivo+redox+status+utilizing+hyperpolarized+%5B1-13C%5D+N-acetyl+cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Real-time insight into in vivo redox status utilizing hyperpolarized [1-13C] N-acetyl cysteine.</a> Sci Rep. 11 (1), 12155(2021).</li>
<li>Düwel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+pH+in+vivo+using+hyperpolarized+13C-labelled+zymonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled zymonic acid.</a> Nat Commun. 8 (1), 15126(2017).</li>
<li>Chen, J., Hackett, E. P., Singh, J., Kovács, Z., Park, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+assessment+of+intracellular+and+extracellular+pH+using+hyperpolarized+%5B1-13C%5Dalanine+ethyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous assessment of intracellular and extracellular pH using hyperpolarized [1-13C]alanine ethyl ester.</a> Anal Chem. 92 (17), 11681-11686 (2020).</li>
<li>Eills, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+hyperpolarization+in+modern+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Spin hyperpolarization in modern magnetic resonance.</a> Chem Rev. 123 (4), 1417-1551 (2023).</li>
<li>Keshari, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+13C+spectroscopy+and+an+NMR-compatible+bioreactor+system+for+the+investigation+of+real-time+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized 13C spectroscopy and an NMR-compatible bioreactor system for the investigation of real-time cellular metabolism.</a> Magn Reson Med. 63 (2), 322-329 (2010).</li>
<li>Sriram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+hyperpolarized+lactate+production+and+efflux+as+a+biomarker+of+tumor+aggressiveness+in+an+MR+compatible+3D+cell+culture+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of hyperpolarized lactate production and efflux as a biomarker of tumor aggressiveness in an MR compatible 3D cell culture bioreactor.</a> NMR Biomed. 28 (9), 1141-1149 (2015).</li>
<li>Mangas-Florencio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DIY+bioreactor+for+in+situ+metabolic+tracking+in+3D+cell+models+via+hyperpolarized+13C+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A DIY bioreactor for in situ metabolic tracking in 3D cell models via hyperpolarized 13C NMR spectroscopy.</a> Anal Chem. 97 (3), 1594-1602 (2025).</li>
<li>Hill, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+free+approach+to+kinetic+analysis+of+real-time+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance+spectroscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Model free approach to kinetic analysis of real-time hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy data.</a> PLoS One. 8 (9), e71996(2013).</li>
<li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C-MR+spectroscopic+imaging+with+hyperpolarized+%5B1-13C%5Dpyruvate+detects+early+response+to+radiotherapy+in+SCC+tumors+and+HT-29+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">13C-MR spectroscopic imaging with hyperpolarized [1-13C]pyruvate detects early response to radiotherapy in SCC tumors and HT-29 tumors.</a> Clin Cancer Res. 21 (22), 5073-5081 (2015).</li>
<li>Sengupta, D., Pratx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+metabolic+heterogeneity+in+cancer%3A+from+PET+to+hyperpolarized+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Imaging metabolic heterogeneity in cancer: from PET to hyperpolarized MRI.</a> Mol Cancer. 15, 43(2016).</li>
<li>Read, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+alginate+hydrogels+for+radiobiological+and+metabolic+studies+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional alginate hydrogels for radiobiological and metabolic studies of cancer cells.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 171, 197-204 (2018).</li>
<li>Meier, S., Jensen, P. R., Karlsson, M., Lerche, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+NMR+probes+for+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized NMR probes for biological assays.</a> Sensors. 14 (1), 1576-1597 (2014).</li>
<li>Kondo, Y., Nonaka, H., Takakusagi, Y., Sando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+nuclear+magnetic+resonance+molecular+probes+for+hyperpolarized+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Design of nuclear magnetic resonance molecular probes for hyperpolarized bioimaging.</a> Angew Chem Int. Ed. 60 (27), 14779-14799 (2021).</li>
<li>Milani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+magnetic+tunnel+to+shelter+hyperpolarized+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">A magnetic tunnel to shelter hyperpolarized fluids.</a> Rev Sci Instrum. 86 (2), 024101(2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ácido pirúvico [1-13C]</td><td>Cambridge Isot ope Laboratories, Inc.</td><td>CLM-8077</td><td></td></tr><tr><td>Impresora 3D</td><td>Elegoo</td><td>Saturno 2</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06729-55</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Kit de circulación externa para bomba</td><td>COMO UNO</td><td>1-4141-02</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Juego de accesorios sin bridas</td><td>GL Sciences Inc.</td><td>6010-46390</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio con núcleo</td><td>Narishige</td><td>GDC-1.5</td><td>Diámetro interior ~0,9 mm, longitud 90 mm</td></tr><tr><td>Bomba de circulación magnética</td><td>COMO UNO</td><td>1-4141-01</td><td></td></tr><tr><td>MestReNova</td><td>Investigación Mestrelab</td><td></td><td>Software de procesamiento y análisis espectral de RMN</td></tr><tr><td>Mi jeringa de inyección</td><td>Corporación Nipro</td><td>8277</td><td>0,5 ml/100U, 30 G x 10 mm, 140 piezas</td></tr><tr><td>OX063</td><td>&nbsp; Oxford Instruments Co. Ltd. y Polarize IVS Co. Ltd.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Tubo PEEK</td><td>COMO UNO</td><td>3-780-05</td><td></td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>26252-94</td><td></td></tr><tr><td>Mini bomba peristáltica Bio</td><td>ATTO</td><td>1221200</td><td>Tipo de caudal amplio y de alta precisión para un flujo medio estable</td></tr><tr><td>Resina</td><td>Tecnología Siraya</td><td>Negro ahumado</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medio</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>30264-85</td><td></td></tr><tr><td>Tabique vial de silicona/PTFE</td><td>GL Sciences Inc.</td><td>1030-50009</td><td></td></tr><tr><td>Alginato de sodio 80-120</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>194-13321</td><td></td></tr><tr><td>Software SPINit</td><td>RS2D</td><td></td><td>Software de RMN en el polarizador DNP</td></tr><tr><td>Esponja</td><td>-</td><td>-</td><td>Esponja disponible comercialmente cortada a medida para la estabilización del gel</td></tr><tr><td>Llave de paso de tres vías</td><td>COMO UNO</td><td>3-6247-04</td><td></td></tr><tr><td>Topspin</td><td>Bruker</td><td></td><td>Software de adquisición y procesamiento de datos de RMN</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07086-74</td><td></td></tr><tr><td>Resina curable UV</td><td>BONDIC</td><td>BD-SKCJ</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>COMO UNO</td><td>1-5832-41</td><td>Robot térmico serie TR TR-1 y alfa; para mantener 37 &deg; Temperatura C</td></tr><tr><td>Wilmad Tubo de RMN con tapón de rosca</td><td>Sigma</td><td>Z271977</td><td>Frecuencia 400 MHz, diámetro 10 mm, L 178 mm.</td></tr></tbody></table>

detección metabólica en tiempo real en células vivas mediante rmn hiperpolarizada de 13c

Real-Time Metabolic Detection in Living Cells Using Hyperpolarized 13C NMR

En este estudio, se acopló un sistema fabricado a una espectroscopia de RMN hiperpolarizada de 13C para medir el metabolismo del piruvato en células vivas en tiempo real. Las principales señales detectadas en el espectro de RMN 1D 13C correspondieron al piruvato (aproximadamente 171 ppm) y al lactato (aproximadamente 183 ppm)21, lo que nos permite evaluar la conversión metabólica del piruvato a lactato en condiciones fisiológicas (Figura 4).
Calidad espectral y dinámica de la señal En la Figura 5 se muestran los resultados representativos de mediciones repetidas en la misma muestra utilizando células SCCVII, una línea de carcinoma de células escamosas de ratón que se usa con frecuencia en estudios de resonancia magnética hiperpolarizada. La primera medición mostró un claro aumento en la señal de lactato, lo que indica una conversión metabólica activa. Sin embargo, las mediciones posteriores tomadas a intervalos de 1,5 h mostraron una disminución progresiva de la actividad metabólica. Esta reducción dependiente del tiempo probablemente refleja el estrés biológico o la adaptación inducida por la inyección inicial de piruvato. En particular, se ha descrito una modulación metabólica transitoria similar in vivo utilizando resonancia magnética hiperpolarizada y EPRI, donde la oxigenación tumoral disminuyó temporalmente después de la administración de piruvato22. Estos resultados demuestran que la repetibilidad de estas mediciones permite un seguimiento no destructivo de los cambios metabólicos dinámicos, una ventaja que es difícil de lograr con métodos destructivos23.
Para evaluar la aplicabilidad de este protocolo a otros tipos de células, se realizaron mediciones adicionales utilizando células HeLa, una línea celular de cáncer humano ampliamente utilizada. Como se muestra en la Figura 6, las células HeLa también mostraron una clara conversión de piruvato a lactato. Aunque la intensidad de la señal disminuyó gradualmente debido a la relajación de T1, la relación señal-ruido siguió siendo suficiente durante todo el período de adquisición de los 60 s. Estos hallazgos sugieren que el protocolo actual es ampliamente aplicable y puede servir como una herramienta versátil para el perfil metabólico en tiempo real en varios tipos de células.
Si bien el decaimiento rápido de la señal es una limitación inherente de la RMN basada en DNP, nuestro sistema de mezcla in situ minimiza el retraso entre la disolución y la medición, mejorando así la sensibilidad de detección. Otros refinamientos, como la optimización de la composición de la matriz de gel, pueden ampliar la aplicabilidad de este método a una gama más amplia de sistemas biológicos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig1.jpg"> 
Figura 1: Diagrama esquemático del flujo de trabajo general desde el cultivo celular hasta la medición de RMN hiperpolarizada. El proceso comienza con el cultivo celular (~ 2 semanas), seguido de la preparación del gel de alginato (~ 60 min) para encapsular las células para una medición estable. A continuación, la hiperpolarización se realiza utilizando un sistema polarizador DNP (~60 min), y la medición de RMN se realiza utilizando un espectrómetro de RMN de 400 MHz (~5 min). Las fotografías de la derecha muestran los instrumentos correspondientes utilizados en este flujo de trabajo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig2.jpg"> 
Figura 2: Configuración del biorreactor para la medición de RMN hiperpolarizada. (A) Diagrama esquemático de la configuración del biorreactor. El medio de cultivo se introduce en el tubo de RMN a través de la entrada A y posteriormente se dirige a los residuos. Las perlas de alginato que contienen células vivas se colocan dentro del tubo de RMN. Durante las mediciones de RMN hiperpolarizada, la sonda hiperpolarizada se inyecta a través de la entrada B, etiquetada como entrada de la sonda hiperpolarizada. (B) Fotografía de toda la configuración del biorreactor, con los tubos de entrada y salida claramente etiquetados. (C) Vista de cerca del interruptor de tubería de entrada, que muestra la entrada A (perfusión media) y la entrada B (inyección de sonda hiperpolarizada). (D) Diseño CAD y (E) fotografía representativa del componente de fijación de esponja impreso en 3D colocado dentro del tubo de RMN. El componente incluye un orificio para guiar un capilar de vidrio que suministra la solución de sustrato hiperpolarizado y una plataforma para sostener una esponja. El componente en sí no encaja firmemente contra la pared interna del tubo de RMN; (F) en su lugar, se inserta una esponja a su alrededor para llenar el espacio. Esta estructura estabiliza el componente y permite que el medio residual fluya hacia arriba a través de la esponja, eliminando la necesidad de un orificio de salida adicional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig3.jpg"> 
Figura 3: Preparación del gel de alginato. (A) Ilustración esquemática y (B) fotografía del aparato de formación de bolas de gel de alginato. La imagen de la izquierda muestra toda la configuración, incluido el tubo de centrífuga con una jeringa fijada a su tapa modificada. La imagen superior derecha muestra una tapa con un pequeño orificio para la punta de la jeringa, mientras que la imagen inferior derecha muestra una tapa con una abertura cuadrada para un posicionamiento estable de la jeringa. El tubo de centrífuga está prellenado con 10 ml de solución de cloruro de calcio, lo que permite que la solución de alginato que sale de la punta de la jeringa se gelifique, formando bolas de gel de alginato. (C) Imagen microscópica representativa que muestra la morfología de las bolas de gel de alginato. (D) Imagen microscópica representativa que muestre la morfología de las bolas de gel de alginato que contienen células HeLa. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig4.jpg"> 
Figura 4: Representación esquemática de los pasos de preparación para la medición de RMN e hiperpolarización. Durante el proceso de acumulación de DNP de ~ 60 minutos, la configuración de RMN se realiza en paralelo para minimizar los retrasos. La preparación implica la carga de perlas de alginato en el tubo de RMN, seguida de un ajuste de bloqueo de 1H, calzamiento y ajuste de la sonda para garantizar que el sistema esté listo para la medición inmediata. Después de la disolución y la mezcla in situ , la espectroscopia de RMN de 13C resuelta en el tiempo revela picos claros de piruvato y lactato. Los picos observados aproximadamente a 171 ppm, 179 ppm y 183 ppm corresponden a piruvato, hidrato de piruvato y lactato, respectivamente. Se utilizaron aproximadamente 4 × 107 células HeLa encapsuladas en gel de alginato para la medición de RMN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig5.jpg"> 
Figura 5: Detección resuelta en el tiempo de señales de piruvato y lactato en mediciones repetidas. Se adquirieron espectros de RMN hiperpolarizados de 13C de la misma muestra encapsulada en células SCCVII a intervalos de 1,5 h para evaluar la viabilidad de mediciones no destructivas repetidas. Las intensidades máximas de piruvato (círculos abiertos) y lactato (círculos llenos, escalados por 1000×) se trazan a lo largo del tiempo para cada adquisición. (A) Primera medición. (B) La segunda medición, después de 1,5 h, revela una marcada reducción en la producción de lactato. (C) La tercera medición, después de otras 1,5 h, confirmó una baja actividad metabólica sostenida. El análisis cuantitativo basado en el área bajo la curva (AUC) mostró que la relación [Lactato]/[Piruvato] disminuyó de 0,00134 (primera medición) a 0,00019 (segunda) y 0,00027 (tercera). La concentración final de células en el gel de alginato fue de aproximadamente 1,0 × 107 células/mL (4 × 107 células en 4 mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig6.jpg"> 
Figura 6: Conversión de piruvato en lactato en células HeLa. Se midieron las señales de RMN hiperpolarizadas de 13C resueltas en el tiempo de piruvato y lactato en células HeLa vivas. La intensidad de la señal de piruvato se normaliza a su valor máximo en el tiempo cero. La intensidad de la señal de lactato se escala por un factor de 103 para la visibilidad. El análisis cuantitativo basado en el área bajo la curva (AUC) mostró una relación [Lactato]/[Piruvato] de 0,00121. La concentración final de células en el gel de alginato fue de aproximadamente 7,5 × 106 células/mL (3 × 107 células en 4 mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
Figura complementaria 1. Imágenes representativas del tabique vial utilizado en el sistema de biorreactor. (A) Tabique de silicona/PTFE (9 mm de diámetro) antes de su uso. (B) El mismo tabique en uso real, con tubos de PEEK insertados a través de orificios perforados. La elasticidad del material del tabique le permite volver a sellarse alrededor de la tubería, manteniendo las condiciones de hermeticidad durante la inyección de sustrato hiperpolarizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S1.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura</a>
Figura suplementaria 2: Espectro de RMN de 13C hiperpolarizado resuelto en el tiempo adquirido después de la mezcla externa. Espectro representativo resuelto en el tiempo del metabolismo del piruvato [1-13C] medido utilizando un sistema de RMN de sobremesa después de la mezcla externa de piruvato hiperpolarizado y células fuera del tubo de RMN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S2_RE.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura</a>
Archivo complementario 1: Diseño CAD del soporte cilíndrico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Supplementary%20file%201_RE.ipt" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo</a>

Detección metabólica en tiempo real en células vivas mediante RMN hiperpolarizada de 13C

The protocol presents a method to integrate an in-house-built bioreactor system with hyperpolarized 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to ...

real-time-metabolic-detection-living-cells-using-hyperpolarized-13c

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

La mejora de la sensibilidad proporcionada por la polarización nuclear dinámica de disolución (DNP) permite seguir los procesos metabólicos en tiempo real mediante RMN y RMN. Se discuten las características y rendimientos de una configuración DNP de disolución dedicada diseñada para el estudio de reacciones enzimáticas.

Disolución dinámica de polarización nuclear Instrumentación para el tiempo real enzimática reacción de la tasa mediciones realizadas por RMN

Un maniquí dinámico multicompartimiento se utiliza para simular alguna biología de interés para estudios metabólicos utilizando agentes de resonancia magnética hiperpolarizados.

El uso de un de varios compartimentos dinámico sola enzima fantasma de Estudios de hiperpolarizados Agentes de Resonancia Magnética

La polarización nuclear dinámica con la posterior disolución de la muestra ha permitido estudios en tiempo real del metabolismo en sistemas biológicos. Se utilizó piruvato hiperpolarizado [1-13C] para estudiar la actividad de la lactato deshidrogenasa en una línea celular de carcinoma de próstata in vitro.

hiperpolarizado 13 C metabólico espectroscopía de resonancia magnética e Imagen

Presentamos un protocolo para medir la dependencia del campo magnético del tiempo de relajación de la celosía de espín de 13compuestos enriquecidos con C, hiperpolarizados mediante polarización nuclear dinámica, utilizando relaxometría rápida de ciclo de campo. Específicamente, lo hemos demostrado con [1-13C]pyruvate, pero el protocolo podría extenderse a otros sustratos hiperpolarizados.

Medición de la dependencia del campo magnético de relajación Spin-Lattice de hiperpolarizado [1-13C]pyruvate

Este protocolo describe la configuración de un biorreactor de RMN para mantener viables las células humanas encapsuladas durante un máximo de 72 h, seguido de la adquisición y el análisis de datos de RMN en las células resueltos en el tiempo. La metodología se aplica para monitorizar las interacciones proteína-ligando intracelular en tiempo real.

Monitoreo de las interacciones proteína-ligando en células humanas mediante RMN cuantitativa en células en tiempo real utilizando un biorreactor de alta densidad celular

Describimos una configuración experimental para administrar metabolitos hiperpolarizados marcados con 13C en modo de perfusión continua a un corazón de ratón perfundido aislado. Un enfoque dedicado de adquisición de 13C-RMN permitió la cuantificación de la actividad enzimática metabólica en tiempo real, y un análisis multiparamétrico de 31R-P permitió la determinación del contenido de ATP tisular y el pH.

Investigación del metabolismo cardíaco en el corazón de ratón perfundido aislado con piruvato hiperpolarizado [1-13C] y espectroscopia de RMN 13C / 31P

Imágenes de fluorescencia vida (Flim) ha surgido como una técnica clave para la imagen del medio ambiente y la interacción de proteínas específicas y colorantes en las células vivas. Flim de los rotores moleculares fluorescentes permite el mapeo de la viscosidad en las células vivas.

Imágenes de fluorescencia vida de rotores moleculares en las células vivas

Hemos desarrollado un citómetro de flujo con ultrasonido inducida por láser para detectar las células del melanoma circulando como un indicador temprano de la enfermedad metastásica.

La detección y aislamiento de las células de melanoma circulantes mediante Flujometría fotoacústica

Este documento demuestra un protocolo para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas por medio de microindentación utilizando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Sistemas que dividen las emisiones de cámara dual para dos colores microscopía de fluorescencia generan secuencias de imágenes en tiempo real con una resolución óptica excepcional y temporal, una exigencia de ciertos ensayos de células en vivo, incluyendo ensayos de adhesión cámara de flujo de placas paralelas. Cuando se emplea software para fusionar las imágenes de los canales de emisión adquiridos simultáneamente, se producen secuencias de imágenes pseudocoloreada.

La captura simultánea imágenes en tiempo real en los dos canales de emisión mediante un sistema de división de doble cámara de emisiones: Las solicitudes de adhesión de células

Aprende a medir el metabolismo del piruvato en células vivas mediante RMN hiperpolarizada de ¹³C en tiempo real. Este protocolo validado mejora la reproducibilidad y precisión cinética para estudios metabólicos y cribado de fármacos.

Detección metabólica en tiempo real en células vivas mediante RMN hiperpolarizada ^{de 13}C

Explorar más videos