Germinación asimbótica y regeneración basada en explantes de hojas de la orquídea medicinal en peligro de extinción Hemipilia cucullata a partir de semillas maduras

Mi investigación se centra en optimizar los protocolos de cultivo de tejidos para orquídeas en peligro de extinción para mejorar la conservación, la propagación a gran escala y la utilización sostenible de estas valiosas plantas medicinales. Un desafío importante es lograr tasas consistentes de germinación y regeneración en todas las especies de orquídeas, ya que cada una requiere la optimización de medios específicos de cada especie y el control preciso de las condiciones de crecimiento. Hemos desarrollado protocolos eficientes de cultivo de tejidos para múltiples plantas en peligro de extinción, lo que permite la recuperación de especies y apoya la reconstrucción en hábitats naturales.

No existe un sistema eficiente de cultivo de tejidos reproducibles para el manejo de la propagación, restauración y conservación de Hemipilia cucullata. Las orquídeas terrestres a menudo necesitan hongos simbióticos específicos cuyo aislamiento e identificación son complejos. Un método simbiótico simplifica la propagación y evita estos pasos.

Nuestra práctica permite una alta germinación y la rápida regeneración de las plantas a partir de estados maduros, eliminando la dependencia de los hongos y ofreciendo un enfoque más rápido y fiable para la propagación de Hemipilia cucullata. Para comenzar, coloque la cápsula en un vaso de precipitados. Agregue una o dos gotas de detergente en el vaso de precipitados para enjuagar.

Lave la cápsula con agua corriente del grifo durante cinco minutos. Luego, con papel absorbente estéril, retire el agua superficial restante de la cápsula. Ahora, sumerja la cápsula en etanol al 75% durante 30 segundos.

Esterilice la cápsula sumergiéndola en 50 mililitros de solución de hipoclorito de sodio al 20% que contenga aproximadamente un 5% de cloro disponible. Luego agregue dos gotas de detergente para lavar platos doméstico sin diluir a la solución e incube la cápsula durante 10 a 12 minutos. Enjuague la cápsula cinco veces con agua destilada estéril para eliminar cualquier desinfectante residual.

Luego, con un bisturí estéril, retire aproximadamente un milímetro de los extremos del ápice y del pedicelo de la cápsula. Haga una pequeña incisión en el extremo superior de la cápsula para exponer las semillas y recójalas en una placa de Petri estéril. Con pinzas estériles, disperse uniformemente aproximadamente de 500 a 600 semillas en cada frasco de cultivo que contenga el medio preparado.

Deje que las semillas absorban agua y se asienten en el fondo del medio líquido. Mantenga los cultivos a 25 grados centígrados con un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas y una intensidad de luz de 36 micromoles por metro cuadrado por segundo. Observe la germinación de las semillas semanalmente.

Registre cualquier cambio morfológico visible y fotografíe los cultivos para documentarlos. Seleccione plántulas sanas de uno a dos centímetros de tamaño sin ennegrecimiento visible o amarilleo completo para el alargamiento de los brotes. Con pinzas esterilizadas y enfriadas, transfiera asépticamente de 8 a 12 plántulas a cada botella que contenga un medio de alargamiento de brotes recién preparado.

Distribuya uniformemente las plántulas dentro de cada botella. Después de cinco semanas de alargamiento de los brotes, seleccione plántulas con brotes completamente desarrollados y hojas sanas para el muestreo de explantes de hojas. Elimine las hojas estériles completamente expandidas de una plántula sana con el bisturí estéril.

Retire la región apical y los márgenes de las hojas. Luego corte cada hoja en segmentos de aproximadamente 0,5 por 0,5 centímetros con un bisturí estéril en condiciones asépticas. Coloque 10 segmentos de hojas en el medio de inducción PLB con la superficie adaxial hacia arriba.

Asegúrese de que cada segmento toque el medio con firmeza. Luego cultívelos durante cinco semanas. Finalmente, evalúe el número de PLB inducidos con éxito y calcule la tasa de inducción como porcentaje.

Registra la altura media de los cogollos en centímetros y cuenta el número de cogollos formados por explante. La germinación de semillas en medio líquido se caracterizó visiblemente por la aparición de embriones verdes de la cubierta de la semilla alrededor de los 60 días, que posteriormente formaron protocormos esféricos a los 80 a 85 días. La tasa de germinación más alta del 72% se logró en medio líquido suplementado con 0,5 miligramos por litro de NAA.

El medio B5 que contiene 0,5 miligramos por litro de benciladenina y 0,2 miligramos por litro de NAA produjo la tasa de proliferación de protocormos más alta con un promedio de 5,3 protocormos recién formados por explante. Los protocormos cultivados en medio B5 con la combinación optimizada de reguladores de crecimiento mostraron un crecimiento vigoroso y una pigmentación verde saludable, superando a los cultivados en medio MS en las mismas condiciones. El mayor número de ramas por plántula con un promedio de cuatro se observó con un miligramo por litro de cada benciladenina y NAA, seguido de cerca por NAA solo con 0,5 miligramos por litro.

El alargamiento de los brotes se mejoró más con la combinación de 0,5 miligramos por litro de benciladenina y un miligramo por litro de NAA, lo que resultó en una altura promedio de las plántulas de 4,8 centímetros. La tasa de inducción más alta de cuerpos similares a protocormos (44,3%) se logró utilizando tres miligramos por litro de benciladenina con 0,2 miligramos por litro de NAA.