Caracterización por imágenes en vivo de los movimientos del centrómero durante la profase meiótica masculina en Arabidopsis thaliana

Nuestra investigación explora la meiosis vegetal, con el objetivo de descubrir mecanismos moleculares que guían el reconocimiento, alineación y emparejamiento homólogo cromosómico durante la progresión meiótica. El reto es visualizar el movimiento cromosómico en perfiles meióticos, lo que requiere imágenes de tejido vivo con alta resolución y velocidad para seguir trayectorias. Para empezar, quita la película protectora del separador de un lado y colócala en el centro de una lámina de cristal.

Luego quita la segunda película protectora. Deposita ocho microlitros de agua del grifo en el centro del separador. Con pinzas, recoge una inflorescencia de uno de los tallos principales.

Coloca la inflorescencia en una nueva lámina situada bajo un microscopio estereoscópico equipado con una regla. Selecciona capullos florales que midan aproximadamente 0,5 milímetros de longitud. Con agujas afiladas, abre suavemente los capullos separando los sépalos y pétalos para conservar solo las anteras.

Transfiere los racimos de antera con delicadeza al agua en la cavidad del separador inmediatamente después de retirar los sépalos y pétalos para evitar la deshidratación. Deposita varios racimos dentro de la cavidad del separador. Para cubrir el portaobjetos con un holgazán de cubierta evitando burbujas de aire, añade ocho microlitros de agua sobre un portafolio.

Luego, invierte cuidadosamente el deslizamiento de la cubierta con la gota de agua hacia la cavidad del separador. Asegúrate de que los racimos de las anteras estén sumergidos en un total de 16 microlitros de agua y que el deslizante de la cubierta se adhiera bien al separador. Instala el microscopio excitando GFP a 488 nanómetros y detectándolo con un detector híbrido entre 494 y 547 nanómetros.

Luego localiza la antera usando iluminación de campo brillante. Utilizando el canal de campo claro, determina la etapa meiótica en función de la forma de las células. Visualiza la antera en el software y utiliza la señal RFP como un indicador adicional de la etapa meiótica de las células.

Para realizar adquisiciones continuas, establece el intervalo de tiempo a cero en la sección de tiempo. Luego usa el módulo de manchas para hacer un seguimiento automático de las manchas. Elige el canal fuente verde y establece el diámetro XY en un micrómetro para el centrómero marcado por GFPCENH3.

Luego modifica la calidad de la detección en función de la intensidad de la señal usando el gráfico en la parte inferior de la ventana de control. Utiliza el algoritmo de seguimiento de movimiento regresivo automático para trazar las trayectorias del centrómero y visualizar todas las trayectorias para distinguir fácilmente los meiocitos de los tejidos somáticos. A continuación, utiliza el módulo de puntos para seguir los puntos a lo largo del tiempo en el núcleo seleccionado.

Define una región de interés seleccionando el segmento de opción solo como una región de interés y realiza un seguimiento spot dentro de ella. Selecciona una región de interés que incluya correctamente el núcleo en las tres dimensiones y a lo largo del tiempo. En un gráfico de linaje, utiliza el visor 3D del software para visualizar todas las trayectorias.

Elimina las trayectorias fuera del meiocito analizado seleccionándolas y pulsando la tecla de supresión en el teclado. En modo edición, elimina o añade un objeto, asegurándote de que se añade en el plano correcto. En modo de editar pistas, conecta manualmente los nuevos objetos en el gráfico de linaje tras analizar a fondo la celda en 3D.

Calcular la velocidad instantánea en cada paso temporal para monitorizar las variaciones en la velocidad de movimiento a lo largo del tiempo. Calcula el ángulo de giro como el cambio de dirección de movimiento entre pasos de tiempo consecutivos para revelar patrones de trayectoria. Guarda el resultado junto con la velocidad instantánea.

Calcula la proporción de alcance usando el cell tracker para medir cuánto se mueve un objeto rastreado respecto a su posición inicial, indicando el comportamiento exploratorio. Calcular la velocidad media de cada pista para resumir las características de movimiento a lo largo del periodo de observación. Calcula el ángulo medio de giro por vía para analizar el movimiento, la direccionalidad y los patrones de comportamiento, y almacena el resultado.

A continuación, calcula el tamaño del centroide en cada paso de tiempo para medir la dispersión espacial de los centrómeros alrededor de su posición media. Utiliza variaciones en el tamaño del centroide a lo largo del tiempo para evaluar la consistencia global entre las pistas del centrómero y almacenar el resultado. Calcular la correlación cruzada de velocidad para analizar las relaciones entre la dinámica de movimiento de diferentes objetos rastreados, revelando posibles comportamientos coordinados.

Luego calcula el desplazamiento cuadrático medio de cada trayectoria para cuantificar la distancia cuadrada media recorrida por los centrómeros en un intervalo de tiempo dado. Los centrómeros meióticos mostraron una velocidad media significativamente mayor de 109,35 nanómetros por segundo en comparación con los centrómeros somáticos. Los centrómeros meióticos mostraron un rango más amplio y una mayor relación de alcance normalizada en comparación con los centrómeros somáticos.

La distribución del ángulo de giro difería entre centrómeros meióticos y somáticos. El desplazamiento cuadrático medio de los centrómeros meióticos aumentó con el tiempo, mientras que los centrómeros somáticos permanecieron en gran medida estáticos. Este protocolo permitió la cuantificación por primera vez del movimiento cromosómico meiótico en Arabidopsis, revelando una dinámica dramática de los centrómeros durante las etapas de cigoteno y paquiteno.

Este protocolo permite estudiar los movimientos de regiones genómicas durante la profase meiótica y puede adaptarse para su aplicación en otras especies vegetales. Estas obras permiten explorar el movimiento cromosómico y la interacción de recombinación, profundizando la comprensión del mecanismo que impulsa la diversidad genética durante la formación de gametos vegetales.