Name: Sobreexpresión y purificación de una nucleasa tóxica de Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprende a sobreexpresar y purificar la nucleasa tóxica Nsp15 de Escherichia coli mediante cromatografía de afinidad y exclusión molecular. Este protocolo permite obtener proteínas difíciles para estudios bioquímicos.

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<ol><li>Francis, D. M., Page, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+optimize+protein+expression+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies to optimize protein expression in E. coli.</a> Curr Protoc Protein Sci. 61 (1), 5.24.1-5.24.29 (2010).</li>
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<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+for+endoribonuclease+nsp15-mediated+regulation+of+alpha-coronavirus+propagation+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Diversity for endoribonuclease nsp15-mediated regulation of alpha-coronavirus propagation and virulence.</a> Microbiol Spectr. 11 (6), e02209-e02223 (2023).</li>
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<li>Zheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+evolution+of+nidovirus+endoribonuclease+based+on+the+finding+that+nsp15+from+porcine+deltacoronavirus+functions+as+a+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Insight into the evolution of nidovirus endoribonuclease based on the finding that nsp15 from porcine deltacoronavirus functions as a dimer.</a> J Biol Chem. 293 (31), 12054-12067 (2018).</li>
<li>Huang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+RNA+cleavage+by+coronavirus+nsp15+endonuclease%3A+evidence+for+acid-base+catalysis+and+substrate-dependent+metal+ion+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of RNA cleavage by coronavirus nsp15 endonuclease: evidence for acid-base catalysis and substrate-dependent metal ion activation.</a> J Biol Chem. 299 (6), 104787(2023).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characterization+of+endoribonuclease+nsp15+encoded+by+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characterization of endoribonuclease nsp15 encoded by Middle East respiratory syndrome coronavirus.</a> J Virol. 92 (22), e00893-e00918 (2018).</li>
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<li>Ricagno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+nsp15+from+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of nsp15 from SARS coronavirus.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 62 (4), 409-411 (2006).</li>
<li>Canal, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+SARS-CoV-2+antiviral+compounds+by+screening+for+small+molecule+inhibitors+of+nsp15+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of nsp15 endoribonuclease.</a> Biochem J. 478 (13), 2465-2479 (2021).</li>
<li>Bhardwaj, K., Guarino, L., Kao, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+nsp15+protein+is+an+endoribonuclease+that+prefers+manganese+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as a cofactor.</a> J Virol. 78 (22), 12218-12224 (2004).</li>
<li>De Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+successful+recombinant+expression+of+disulfide+bond-dependent+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli.</a> Microb Cell Fact. 8 (1), 26(2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro; m PES, esterilizante, baja unión a proteínas, sistema de filtro, 1 L</td><td>Corning</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la serina proteasa AEBSF</td><td>Goldbio</td><td>30827-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Agar bacteriológico</td><td>Amresco</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Sistema de purificación KTA go</td><td>Cytiva</td><td>29383015</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador Amicon Ultra de 15 ml, 30 kDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina sódica</td><td>Goldbio</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de batido con deflectores</td><td>Nalgene&nbsp;</td><td>F0527</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5920R</td><td></td></tr><tr><td>Biofotómetro plus</td><td>Eppendorf</td><td>E-BP6132</td><td></td></tr><tr><td>Trombina bovina</td><td>BioPharm</td><td>91-030</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de colorante Bradford</td><td>Bioproductos de Boston</td><td>BPA-200</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114931</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Baño seco digital</td><td>Bio Rad</td><td>1660562</td><td></td></tr><tr><td>Esparcidores desechables, en forma de L</td><td>Socios de MedSupply</td><td>62-1014-1</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Goldbio</td><td>27565-41-9</td><td></td></tr><tr><td>DNasaI del páncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Molinillo de tejidos Douce, 40 ml</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de cromatografía de columna económica</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1532</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador nutador minimix de enduro</td><td>Labnet</td><td>S0600</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Excelente agitador E25R Inc/Ref</td><td>Eppendorf</td><td>NB-E25R</td><td></td></tr><tr><td>FastPette V2</td><td>Labnet</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ángulo fijo Fiberlite F10-4x1000 LEX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>096-041075</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ángulo fijo Fiberlite F21-8x50y</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>096-084275</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc EZ Imager</td><td>Bio-Rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placa caliente</td><td>VWR</td><td>12365-346</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>VWR</td><td>BDH3028</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Goldbio</td><td>I-902-25</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil-&szlig;-D-tiogalactiósido (IPTG)</td><td>Goldbio</td><td>12481C25</td><td></td></tr><tr><td>Células de E. coli competentes con Lemo21 (DE3)</td><td>Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra</td><td>C2528J</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de manganeso (II) tetrahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 0,5 ml</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 1,7 ml</td><td>Socios de MedSupply</td><td>15-1151</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 2 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>Célula de electroforesis vertical tetra Mini-PROTEAN</td><td>Bio-Rad</td><td>10025025</td><td></td></tr><tr><td>Geles de tris-glicina Mini-Protean, 4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>4568094</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge mini centrfuge</td><td>Socios de MedSupply</td><td>C1008-B</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Botella centrífuga de 1 L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3141-1006</td><td></td></tr><tr><td>Tubo centrífugo de cresta de roble Nalgene</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31139-0050</td><td></td></tr><tr><td>Nanofotómetro</td><td>Implen</td><td>3769</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora sin agitación</td><td>Labnet</td><td>I 5110&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sobreexpresar C41 (DE3) células químicamente competentes</td><td>Tecnologías de biobúsqueda</td><td>60442-1</td><td></td></tr><tr><td>Sobreexpresar C41 (DE3) células químicamente competentes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CMC0017</td><td>Terminado; Las células Biosearch C41 (DE3) o las células NEB Lemo21 son una alternativa</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Socios de MedSupply</td><td>62-1077-3</td><td></td></tr><tr><td>Plásmidos (columna vertebral pET-14b)</td><td>Genscript</td><td>Pedido personalizado</td><td></td></tr><tr><td>Microcubetas de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación PowerPacuniversal</td><td>Bio-Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de deslizamiento de precisión</td><td>Becton Dixon</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Estándares de precisión más proteína sin teñir</td><td>Bio-Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>Medio de recuperación para la expresión</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CMR0001K</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de cubeta basculante S-4x1000</td><td>Eppendorf</td><td>EP-S4X1</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica, 10 ml</td><td>Faclon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica, 25 mL</td><td>Faclon</td><td>35725</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica, 5 ml</td><td>Faclon</td><td>35743</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica, 50 mL</td><td>Pr1ma</td><td>PR-Sero-50</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido sódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Desmembrador sónico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB505</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall Lynx 4000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75006580</td><td></td></tr><tr><td>Columna Spephadex G-25 M PD-10</td><td>Cytiva</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-Mercaptoetanol</td><td>Millipore</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados Griffin de acero inoxidable</td><td>Artículos polares</td><td>13977-010-EA</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estériles Falcon, 15 ml</td><td>Halcón</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estériles Falcon, 50 ml</td><td>Halcón</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Columna Superdex 200 10/300 GL</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas, 1 ml</td><td>Air-Tite&nbsp;</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas, 3 ml</td><td>Becton Dixon</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Resina de afinidad metálica TALON</td><td>Takara</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Palillos</td><td>Calle de la Creatividad</td><td>PAC3690-01</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Goldbio</td><td>T-400-1</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>MP Biomédica</td><td>807423</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Investigación Productos Internacional</td><td>T60065</td><td></td></tr><tr><td>Vornado</td><td>Punto de referencia</td><td>BV101-G</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Investigación Productos Internacional</td><td>Año 20025</td><td></td></tr></tbody></table>

sobreexpresión y purificación de una nucleasa tóxica de escherichia coli

Overexpressing and Purifying a Toxic Nuclease from Escherichia coli

Debido a la toxicidad de Nsp15 como nucleasa, generalmente se requería un total de ~ 7 h para que los cultivos iniciadores alcanzaran un OD600 de 0.8-1.0. Una vez inoculado, normalmente se requería un total de ~3-5 h para el mismo OD600 óptimo de 0,8-1,0 para la inducción. En este caso, el tiempo de duplicación parecía ser de ~ 1 h. Cuando se expresó un mutante catalítico muerto de Nsp15, la duplicación de las células de E. coli parecía normal (~ 20 min), una prueba más de que la actividad ...

Sobreexpresión y purificación de una nucleasa tóxica de Escherichia coli

Escherichia coli has been widely employed as an expression system to produce recombinant proteins. Yet some types of recombinant proteins, such as ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Transducción de la proteína permite la entrega directa de proteínas biológicamente activas en las células. En contraste con los métodos convencionales, tales como la transfección de ADN o transducción viral de este paradigma no invasiva permite la manipulación celular de alta eficiencia de una manera valorable eludir la toxicidad celular y el riesgo de la transformación oncogénica de la modificación genética permanente.

Ingeniería penetran en las células de proteínas

Sistemáticos ya gran escala sintéticos genéticos (gen-gen o epistasis) pantallas de interacción puede ser utilizado para explorar la redundancia genética y la vía de la diafonía. A continuación, se describe un alto rendimiento cuantitativo sintético tecnología de detección genética amplia, denominada eSGA que hemos desarrollado para la aclaración de las relaciones y explorar epistatic interacción en redes...

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Las exonucleasas desempeñan un papel fundamental para garantizar la estabilidad del genoma. La pérdida de la función de la exonucleasa WRN provoca un envejecimiento prematuro. El estudio de los sustratos y otros requisitos de la nucleasa in vitro puede ayudar a dilucidar su papel in vivo. Aquí demostramos un ensayo rápido y reproducible basado en fluorescencia para medir su actividad nucleasa.

Un ensayo de exonucleasa basado en fluorescencia para caracterizar DmWRNexo, ortólogo de la exonucleasa WRN progeroide humana, y su aplicación a otras nucleasas

Este protocolo de cinco días se esbozan todos los pasos, el equipo y el software complementario necesario para la creación y ejecución de un eficiente Escherichia coli endógeno basado sistema de expresión libre de células TX-TL a partir de cero. Con los reactivos, el protocolo de toma 8 horas o menos a la configuración de una reacción, recopilar y procesar datos.

Los protocolos para la implementación de un Escherichia coli Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

La coexpresión de proteínas es una poderosa alternativa a la reconstitución in vitro de complejos proteicos, y es de ayuda en la realización de pruebas bioquímicas y genéticas in vivo. En este trabajo se informa sobre el uso de la coexpresión de proteínas en Escherichia coli para obtener complejos proteicos y ajustar la frecuencia de mutación de las células.

Las multifacéticas beneficios de la proteína co-expresión en<em&gt; Escherichia coli</em

Un método de alto rendimiento para la purificación negativa de un solo paso de Helicobacter pylori recombinante proteína activadora de neutrófilos (HP-PAN) sobreexpresado en Escherichia coli mediante el uso de resinas de dietilaminoetilo en modo batch se describe. HP-PAN purificado por este método es beneficioso para el desarrollo de vacunas, medicamentos o diagnósticos para H. pylori -asociado enfermedades.

De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; La proteína activadora de neutrófilos sobreexpresa en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En modo batch

Un protocolo simple para la sobreexpresión y purificación de la cis- preniltransferasa humana optimizada con codones, en condiciones no desnaturalizantes, de Escherichia   Coli , junto con un ensayo de actividad enzimática. Este protocolo puede generalizarse para la producción de otras proteínas de cis- preniltransferasa en cantidad y calidad adecuadas para estudios mecánicos.

Sobreexpresión y Purificación de Humanos Cis -preniltransferasa en Escherichia coli

Aquí presentamos un protocolo para el uso de preexistentes antibiótico resistencia-cassette borrado construcciones como base para la fabricación de mutantes de deleción en otras cepas de e. coli . Tales mutaciones de la canceladura pueden ser movilizados e inserta en el correspondiente locus de una cepa receptora mediante transducción de bacteriófago P1.

Producción de canceladuras del Gene en Escherichia coli por transducción de P1 con casetes de resistencia a los antibióticos

Protocatechuato 3,4-dioxigenasa (PCD) puede eliminar enzimáticamente el oxígeno diatómico libre de un sistema acuoso utilizando su sustrato ácido protocatecúrico (PCA). Este protocolo describe la expresión, purificación y análisis de actividad de esta enzima de barrido de oxígeno.

Expresión y purificación de la distribución de oxígeno libre de nucleasa Protocatechuato 3,4-Dioxigenasa

Las endonucleasas de restricción con nueva especificidad de secuencia se pueden desarrollar a partir de enzimas que reconocen una secuencia parcialmente degenerada. Aquí proporcionamos un protocolo detallado que utilizamos con éxito para alterar la especificidad de la secuencia de la enzima NlaIV. Los ingredientes clave del protocolo son la compartimentación in vitro de la reacción de transcripción/traducción y la selección de variantes con nuevas especificidades de secuencia.

In Vitro dirigió la evolución de una endonucleasa de restricción con una especificidad más estricta

Las bacterias secretan vesículas extracelulares (EV) de tamaño nanométrico que transportan moléculas biológicas bioactivas. La investigación EV se centra en comprender su biogénesis, su papel en las interacciones y enfermedades microbio-microbio y huésped-microbio, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se presenta un flujo de trabajo para el aislamiento escalable de vehículos eléctricos de varias bacterias para facilitar la estandarización de la investigación de vehículos eléctricos.

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

Aprende a sobreexpresar y purificar la nucleasa tóxica Nsp15 de Escherichia coli mediante cromatografía de afinidad y exclusión molecular. Este protocolo permite obtener proteínas difíciles para estudios bioquímicos.

Sobreexpresión y purificación de una nucleasa tóxica de Escherichia coli

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