Sobreexpresión y purificación de una nucleasa tóxica de Escherichia coli

Nuestro laboratorio tiene como objetivo caracterizar estructural y bioquímicamente una endonucleasa conservada que se encuentra en los nidovirus, incluidos los coronavirus, para desarrollar un modelo evolutivo y proporcionar una base para objetivos terapéuticos. Las nucleasas pueden ser difíciles de expresar en los sistemas de E. coli debido a la actividad enzimática en el ADN celular o el ARN, lo que puede resultar en un crecimiento lento y bajos rendimientos de proteínas. Nuestro hallazgo nos permitirá purificar nucleasas tóxicas de otros nidovirus para posteriores estudios bioquímicos y estructurales.

Para comenzar, use un matraz Erlenmeyer esterilizado de 50 mililitros por cada litro de cultivo y prepare dos o tres matraces adicionales como cultivos iniciadores. Etiquete uno de los matraces con una estrella para designarlo para las comprobaciones de densidad óptica, ya que sus mediciones representarán todo el crecimiento, a menos que haya una diferencia visual entre los matraces. Usando un cilindro graduado, prepare una mezcla maestra combinando 60 mililitros de medio 2X TY y 60 microlitros de solución madre de ampicilina descongelada a menos 20 grados Celsius.