Extracción de histonas de muestras clínicas para perfilado epigenético mediante espectrometría de masas

El alcance de nuestra investigación es analizar los cambios epigenéticos en muestras de cáncer, descubrir nuevos biomarcadores diagnósticos y pronósticos, e identificar posibles objetivos para la terapia. Un gran desafío con las muestras clínicas es el material limitado y los artefactos inducidos por fijación. Sin embargo, con nuestro flujo de trabajo optimizado y la EM de sensibilidad di, podemos cuantificar hasta 50 PTM de histonas a partir de solo 1000 células.

Demostramos que la espectrometría de masas puede cuantificar los cambios PTM de las histonas en la muestra clínica, ofreciendo información sobre el mecanismo epigenético y permitiendo el descubrimiento de biomarcadores e identificación de blancos farmacológicos para terapias epigenéticas de precisión. Nuestro protocolo aborda la necesidad de un perfilado robusto, cuantitativo y sensible sobre la PTM de histonas en diversos tipos de muestras clínicas. La espectrometría de masas es ideal para el análisis PTM de histonas, ya que ofrece detección sesgada, perfilado simultáneo y co-ocurrencia en el mismo péptido, superando así las limitaciones de los métodos basados en anticuerpos.

Para empezar, descongela el tejido fresco congelado sobre hielo y, usando un bisturí o cuchilla, corta un trozo de aproximadamente 20 a 30 miligramos correspondiente a unos dos milímetros cúbicos de tejido. Transfiere la muestra de tejido cortado a un tubo de 1,5 mililitros. Con tijeras, pica el papel en trozos pequeños.

Añadir un mililitro de tampón de aislamiento de núcleos recién preparado, complementado con los inhibidores de proteasas especificados, y picar el tejido de nuevo. Transfiere la muestra a un homogeneizador hacia abajo. Usando primero el mano suelto y luego el mano apretado, homogeneiza el tejido hasta que no queden piezas visibles a simple vista.

Filtra la muestra homogeneizada a través de un colador de células de 100 micrómetros para eliminar los restos de tejido. Pipetear vigorosamente la muestra filtrada arriba y abajo usando una pipeta de 200 microlitros para disolver la membrana plasmática. Transfiere la muestra a un tubo nuevo de 1,5 mililitros.

Coloca el tubo en una centrífuga de mesa y haz girar a 2.300 G durante 15 minutos a cuatro grados Celsius para pelletar los núcleos. Tras descartar el sobrenadante, se resuspende el pellet nuclear en 50 a 100 microlitros de tampón de aislamiento de núcleos, suplementado con SDS al 0,1% para disolver la membrana nuclear. Luego se añaden 250 unidades de nucleasa de Benzonasa a la muestra resuspendida para digerir los ácidos nucleicos.

Mezcla bien y incuba durante dos minutos a 37 grados Celsius. Para una temperatura de corte óptima de las muestras congeladas, lava los tejidos con agua de etanol y PBS antes de picar y extraer histonas. Añade un mililitro de agente disolvente de parafina a la muestra de FFPE, tomada en un tubo de 1,5 mililitros y vórtice a máxima velocidad durante 30 segundos hasta que la parafina esté completamente disuelta.

Centrifugar la muestra a 16.000 g durante tres minutos a temperatura ambiente y descartar cuidadosamente el sobrenadante usando una pipeta con una punta pequeña, evitando el pellet. Ahora añade un mililitro de etanol al 95% al pellet y al vórtice a máxima velocidad durante 30 segundos. Centrifugar la muestra a 16.000 G durante tres minutos a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.

Después de rehidratar la muestra, añade 200 microlitros de buffer de extracción al pellet. Homogeneiza el tejido en el buffer de extracción fornicando con un significante digital usando una punta micro de tres milímetros. Tras la homogeneización, incubar la muestra en un mezclador térmico y abrir brevemente la tapa del tubo para dejar que el formaldehído se evapore.

Tras centrifugar la muestra, transfiere el sobrenadante a un nuevo tubo etiquetado. Elimina las bandas de gel correspondientes al peso molecular de las proteínas histonas centrales situadas entre 10 y 18 kilodaltones usando un bisturí. Después de cortar las bandas de gel, usa el mismo bisturí para transferir los trozos de gel cortados a un tubo de 1,5 mililitros.

Para eliminar el gel, añade una solución del 50% de acetonitrilo en agua destilada doble e incuba el tubo en un mezclador térmico a 1.400 revoluciones por minuto durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deshidrata las piezas de gel añadiendo 100% acetonitrilo. Mezcla en la termomezcladora a 1.400 revoluciones por minuto durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Después de desechar el sobrenadante, seca las piezas de gel durante cinco minutos a temperatura ambiente en una centrífuga al vacío. A continuación, añadir 15 microlitros de solución de propoñicanhidruro de 7,7 molares y 26 microlitros de un molar de bicarbonato de amonio a cada tubo e incubar. Luego incubar la muestra con 80 microlitros de un molar de bicarbonato de amonio.

Luego lava los trozos de gel tres veces con agua destilada doble y desecha el líquido tras cada incubación. Después, añade un 50% de acetona nitrilo a las piezas de gel e incuba a 1.400 revoluciones por minuto durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego añade 100% acetonitrilo para deshidratar completamente las piezas de gel.

Incuba en el mezclador térmico a 1.400 revoluciones por minuto durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el líquido, seca los trozos de gel durante cinco minutos a temperatura ambiente en una centrífuga al vacío. Añade cuatro microlitros de solución de tripsina y 20 microlitros de buffer de digestión a cada tubo que contiene piezas de gel.

Incuba los tubos sobre hielo durante 10 minutos para permitir la absorción de la tripsina en el gel. Una vez que la tripsina esté completamente absorbida, añade 80 microlitros de buffer de digestión para cubrir completamente las piezas de gel e incuba los tubos durante la noche a 37 grados Celsius en un mezclador térmico. Para extraer los péptidos digeridos, añade 100 microlitros de nitrilo 100% aceto a cada tubo e incuba a 1.400 revoluciones por minuto durante 20 minutos a temperatura ambiente en un mezclador térmico.

Ahora, recoge cuidadosamente el sobrenadante y transfiere a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Después de repetir la extracción de nitro aceto con el gel restante, agrupa los supernadantes. Concentra los péptidos agrupados en una centrífuga de vacío hasta que el volumen esté entre uno y cinco microlitros.

Luego añade dos microlitros de bicarbonato de trietilamonio molar y tres microlitros de solución de isocianato de fenilo. Incuba la muestra a 350 revoluciones por minuto durante 90 minutos a 37 grados Celsius en un mezclador térmico. Para detener la derivización, añade ocho microlitros de ácido tricloroacético al 1% a cada tubo.

Finalmente, diluye cada muestra añadiendo 100 microlitros de buffer A y carga las muestras diluidas sobre las puntas de la etapa C18 para su elución. La extracción de histonas se logró con éxito a partir de muestras frescas congeladas, OCT congeladas y FFPE utilizando flujos de trabajo diferenciales de procesamiento específicos para cada tipo de tejido. A pesar de menor enriquecimiento y presencia de proteínas de fondo, se extrajeron con éxito las histonas H3, H2A, H2B y H4 de muestras de FFPE, como lo muestran las bandas en el FFPE1 y FFPE2 de Lane, alineándose con aproximadamente un microgramo del estándar H3.1.

La nanocromatografía líquida y el análisis de esclerosis múltiple de histonas derivadas de FFPE mostraron una separación exitosa de péptidos de histonas a lo largo de un gradiente de 55 minutos con picos claros de tiempo de retención mostrados en la cromatografía iónica total. Los cromatogramas iónicos extraídos confirmaron la detección y cuantificación de formas no modificadas y metiladas de H3 K 4 con perfiles de elución separados para cada valor M por Z. Lo que permite el cálculo del porcentaje de abundancia relativa para cada modificación.

El análisis comparativo de las modificaciones de histonas entre muestras normales y tumorales reveló aumentos significativos en ciertos tipos y una disminución en otros tipos en los tejidos tumorales.