Name: Uso de las herramientas de optogenética LEXY y LINuS y análisis automatizado de imágenes para cuantificar la dinámica de transporte nucleocitoplasmático en células vivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprende a utilizar herramientas optogenéticas LEXY y LINuS con análisis automatizado de imágenes para cuantificar la dinámica del transporte nucleocitoplasmático en células vivas. Este protocolo mejora la eficiencia en la investigación de biología celular.

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<ol><li>Wing, C. E., Fung, H. Y. J., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyopherin-mediated+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Karyopherin-mediated nucleocytoplasmic transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23, 307-328 (2022).</li>
<li>Kelley, J. B., Paschal, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+quantification+of+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based quantification of nucleocytoplasmic transport.</a> Methods. 157, 106-114 (2019).</li>
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<li>Zayner, J. P., Antoniou, C., Sosnick, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+terminal+helix+modulates+light+activated+conformational+changes+in+AsLOV2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The amino terminal helix modulates light activated conformational changes in AsLOV2.</a> J Mol Biol. 419 (1-2), 61-74 (2012).</li>
<li>Wehler, P., Niopek, D., Eils, R., Di Ventura, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+nuclear+protein+import+in+living+cells+using+light-inducible+nuclear+localization+signals+%28LINuS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of nuclear protein import in living cells using light-inducible nuclear localization signals (LINuS).</a> Curr Protoc Chem Biol. 8 (2), 131-145 (2016).</li>
<li>Lataster, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+optogenetically+regulated+cell+cycle+inhibitor+protein+p21%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by optogenetically regulated cell cycle inhibitor protein p21.</a> Biology. 12 (9), 1194(2023).</li>
<li>Forlani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+slow-cycling+variants+of+the+light-inducible+nuclear+protein+export+system+LEXY+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of slow-cycling variants of the light-inducible nuclear protein export system LEXY in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 11 (10), 3529-3533 (2022).</li>
<li>Inutsuka, A., Kimizuka, N., Takanohashi, N., Yakabu, H., Onaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+blue+light+transmission+area+in+living+animals+using+light-induced+nuclear+translocation+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Visualization of a blue light transmission area in living animals using light-induced nuclear translocation of fluorescent proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 522 (1), 138-143 (2020).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmidt%2C+U+%22Medical+Image+Computing+and+Computer+Assisted+Intervention+-+MICCAI+2018%22">Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018</a>. Frangi, A. F., Schnabel, J. A., Davatzikos, A. F., Alberola-López, C., Fichtinger, G. , Springer International Publishing. Cham. 265-273 (2018).</li>
<li>Yoo, T. Y., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-GlcNAc+modification+of+nuclear+pore+complexes+accelerates+bidirectional+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">O-GlcNAc modification of nuclear pore complexes accelerates bidirectional transport.</a> J Cell Biol. 220 (7), e202010141(2021).</li>
<li>Jainchill, J. L., Aaronson, S. A., Todaro, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+sarcoma+and+leukemia+viruses%3A+assay+using+clonal+lines+of+contact-inhibited+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine sarcoma and leukemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells.</a> J Virol. 4 (5), 549-553 (1969).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nat Commun. 6, 8497(2015).</li>
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<li>Soderholm, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importazole%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+the+transport+receptor+importin-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Importazole, a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-β.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 700-708 (2011).</li>
<li>Henderson, B. R., Eleftheriou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+activity%2C+sequence+specificity%2C+and+CRM1-dependence+of+different+nuclear+export+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A comparison of the activity, sequence specificity, and CRM1-dependence of different nuclear export signals.</a> Exp Cell Res. 256 (1), 213-224 (2000).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+nuclear+localization+signals+and+mechanisms+of+protein+import+into+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signaling%22%5BJournal%5D)">Types of nuclear localization signals and mechanisms of protein import into the nucleus.</a> Cell Commun Signaling. 19 (1), 60(2021).</li>
<li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), dev175067(2019).</li>
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<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitchhiking+of+Cas9+with+nucleus-localized+proteins+impairs+its+controllability+and+leads+to+efficient+genome+editing+of+NLS-free+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Hitchhiking of Cas9 with nucleus-localized proteins impairs its controllability and leads to efficient genome editing of NLS-free Cas9.</a> Mol Ther. 32 (4), 920-934 (2024).</li>
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La importancia del transporte nucleocitoplasmático (NCT) para regular las vías celulares clave y mantener la homeostasis celular ha sido bien estudiada en los últimos años1. En consecuencia, se generaron varias herramientas para estudiar la dinámica de la NCT 2,3,4. Entre estas herramientas, las sondas optogenéticas LINuS5 y LEXY6, publicadas respectivamente en 2014 y 2016, proporcionan una forma poderosa de monitorear NCT en células vivas. Estas herramientas, diseñadas para seguir la exportación inducible (LEXY) o la importación (LINuS) de un indicador fluorescente, son inducibles por exposición a la luz azul y reversibles.
En resumen, estas dos pequeñas sondas utilizan las propiedades del dominio LOV2 de la proteína fototropina-1 de la planta Avena sativa7. En ausencia de luz azul, la hélice Jα del dominio LOV2 se fotojaula y se incrusta en el núcleo de la proteína. Como la hélice Jα puede responder a los estímulos luminosos, la iluminación por luz azul induce un cambio conformacional y el posterior desacoplamiento de la hélice Jα del dominio LOV2. Los autores de LEXY y LINuS utilizaron esta sensibilidad a la luz para fusionar una señal de localización nuclear (NLS) o una señal de exportación nuclear (NES) a la hélice Jα, para LINuS y LEXY, respectivamente (Figura 1). La herramienta resultante es una sonda que se transloca al núcleo (LINuS) o al citosol (LEXY) tras la iluminación con luz azul.
Para rastrear las sondas con imágenes fluorescentes, también se agregó un reportero fluorescente mCherry a las construcciones. Finalmente, se añadió al sistema un NES débil (para LINuS) o NLS (para LEXY) para garantizar que las sondas no estuvieran en su localización final antes de la iluminación con luz azul, lo que evitaría observar la translocación de LEXY o LINuS entre el núcleo y el citosol.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig1.jpg"> 
Figura 1: Representación de las sondas LEXY y LINuS. Ambas sondas constan de una proteína mCherry fusionada con el dominio LOV2 sensible a la luz. La diferencia entre las dos herramientas reside en la secuencia de señalización oculta por la hélice Jα: una NES para LEXY y una NLS para LINuS. Ambas sondas también poseen una secuencia de señal débil para controlar su localización inicial: un NLS débil para LEXY y un NES débil para LINuS. Por lo tanto, la activación de los sistemas mediante iluminación con luz azul induce su exportación para LEXY o su importación para LINuS, lo que permite a los usuarios controlar la exportación o importación nuclear. Abreviaturas: LEXY = sistema de exportación nuclear inducible por luz; LINuS = señal de localización nuclear inducible por luz; NLS = señal de localización nuclear; NES = señal de exportación nuclear. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La localización de la fluorescencia mCherry informa de la transmisión de las sondas LEXY y LINuS entre los núcleos y el citosol, por lo que puede seguirse en imágenes de células vivas, lo que permite a los usuarios monitorizar la NCT. Además de ser utilizados como sondas simples, LEXY y LINuS también pueden ser diseñados para controlar la localización y estudiar proteínas de interés, in vitro 5,6,8,9 o in vivo 10,11.
El método de cuantificación propuesto en las publicaciones de LEXY y LINuS muestra la intensidad nuclear relativa de las sondas. El análisis sugerido se realiza manualmente y se basa en la medición de una región de interés (ROI) en el núcleo y el citosol. Aunque este método proporciona una buena representación de la señal de la sonda a lo largo del tiempo, es muy largo y tedioso, especialmente cuando se repiten experimentos y condiciones. Es importante destacar que este método también carece de precisión, ya que solo se representa una pequeña parte del compartimento diseñado.
Aquí proponemos un nuevo protocolo para la cuantificación de señales fluorescentes LEXY y LINuS. Implementamos técnicas automatizadas, que facilitan los análisis y proporcionan una mayor precisión. Esto facilitará el proceso para los nuevos usuarios de estas herramientas y ayudará a aumentar el rendimiento. Nuestro protocolo de cuantificación utiliza una sola interfaz, el plugin de código abierto TrackMate12 de FIJI. En particular, para mejorar la fiabilidad de las cuantificaciones, utilizamos un marcador de ADN rojo lejano compatible con imágenes en vivo para realizar la segmentación de todo el núcleo con StarDist13, una red neuronal convolucional entrenada, combinada con el seguimiento y la medición de la señal fluorescente de la sonda con TrackMate12.
Los datos obtenidos se pueden exportar fácilmente a la hoja de cálculo provista y lista para usar (Tabla Suplementaria S1) para obtener la intensidad nuclear relativa de cada núcleo identificado. Este protocolo también explica cómo agrupar los valores obtenidos en un gráfico ajustando la curva de curso de tiempo obtenida a un modelo monoexponencial, como en Yoo y Mitchison14 y cómo calcular la velocidad de transporte para las diferentes condiciones probadas. Con este protocolo y la hoja de cálculo proporcionada para el análisis, los usuarios podrán cuantificar fácilmente los datos de imágenes de células vivas, incluso con habilidades bioinformáticas limitadas.

<table><tbody><tr><td>Colágeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>LEICA</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Sobresalir</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Software FIJI</td><td>FIJI</td><td></td><td>ImagenJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322</td></tr><tr><td>Fluoróplatos</td><td>Dutscher</td><td>FD3510-100</td><td>Alternativa: Cámara de attofluor (Invitrogen #A7816)</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.4.1</td><td>Software GraphPad, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Importazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0341</td><td></td></tr><tr><td>Leptomicina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido LEXY</td><td>Addgene</td><td>72655</td><td>pDN122</td></tr><tr><td>Plásmido LINuS</td><td>Addgene</td><td>61347</td><td>pDN77</td></tr><tr><td>Pencillina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sin rojo de fenol</td><td>Gibco</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>ADN SiR</td><td>Espirocromo</td><td>SC007</td><td>Alternativa: SPY-DNA650 (Espirocromo #SC501)</td></tr><tr><td>Plugin 2D de Stardist</td><td>Dist estelar</td><td></td><td>StarDist_0.3.0</td></tr><tr><td>Complemento TrackMate</td><td>Compañero de pista</td><td></td><td>TrackMate-7.14.0</td></tr></tbody></table>

uso de las herramientas de optogenética lexy y linus y análisis automatizado de imágenes para cuantificar la dinámica de transporte nucleocitoplasmático en células vivas

Using LEXY and LINuS Optogenetics Tools and Automated Image Analysis to Quantify Nucleocytoplasmic Transport Dynamics in Live Cells

El protocolo mencionado anteriormente debe permitir a los usuarios visualizar la localización y translocación de la sonda durante la adquisición en imágenes de células vivas. En la Figura 4 se muestra un ejemplo de las imágenes esperadas adquiridas para visualizar la exportación nuclear con LEXY. Se debe observar una rápida disminución de la señal del núcleo y un enriquecimiento en el citosol después de un par de rondas de iluminación con luz azul. Una recuperación progresiva de la señal de la sonda puede ser visible después de detener los ciclos de iluminación. Para controlar el sistema, la leptomicina B, un inhibidor de la exportación, atestigua que con los análisis se puede visualizar un cambio en la exportación, ya que evita que LEXY se exporte con iluminación de luz azul (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig4.jpg"> 
Figura 4: Visualización de la señal de LEXY a lo largo del tiempo. Captura de puntos de tiempo representativos de las fases estable, de iluminación y de recuperación, adquiridos con imágenes de células vivas. La condición de metanol representa la condición de control. Tras la iluminación pulsátil de luz azul, en rojo, la señal fluorescente mCherry, reportera de la ubicación de LEXY, se transloca del núcleo al citosol. Después de detener la iluminación, la señal se recupera en el núcleo. El tratamiento con el inhibidor de la exportación Leptomicina B a 1 nM o 0,5 nM muestra la ausencia o disminución de la exportación de LEXY cuando la exportación está bloqueada. Barra de escala = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En cuanto a los análisis, mientras que los valores de la curva de intensidad nuclear relativa durante la fase estable deberían estar en torno a 1, después de la activación de la luz azul, deberían mostrar una disminución lenta hasta alcanzar una meseta al final de la fase de iluminación (Figura 5A). Si la disminución es demasiado rápida o demasiado lenta, se pueden optimizar los parámetros de adquisición (ver discusión). El tratamiento con leptomicina B a concentraciones suficientes también puede confirmar que los análisis y la técnica son lo suficientemente sensibles como para demostrar que la exportación nuclear está completamente bloqueada, con valores de intensidad nuclear relativa estables en torno a 1 durante todo el experimento. Sin embargo, las concentraciones intermedias de leptomicina B deberían mostrar una exportación nuclear leve (Figura 5A). Estas observaciones visuales deben confirmarse cuantitativamente con la obtención de la tasa de exportación (Figura 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig5.jpg"> 
Figura 5: Intensidad nuclear relativa esperada de LEXY y velocidad de transporte. (A) El gráfico representa la intensidad nuclear relativa de la señal fluorescente de LEXY a lo largo del tiempo, normalizada a la intensidad media mCherry de la fase estable. La intensidad nuclear relativa de la condición de metanol (control, rojo) disminuye a la mitad después de la iluminación, en contraste con las células tratadas con el inhibidor de exportación Leptomicina B, a una concentración de 0,5 nM (azul claro) o 1 nM (azul oscuro). Barras de error: SEM. (B) Tasa de exportación de las condiciones control y Leptomicina B, obtenida ajustando la curva a un modelo monoexponencial. Los valores obtenidos cuando la exportación es bloqueada por Leptomicina B son significativamente más bajos que la condición de control. N = 18 células para metanol (rojo), 19 células para leptomicina B 0,5 nM (azul claro) y 15 células para leptomicina B 1 nM (azul oscuro). Los valores de p se calcularon mediante una prueba t de Welch bilateral. : P &lt; 1×10−4, ****: P &lt; 1×10−5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla complementaria S1: Hoja de cálculo con cálculos predefinidos. Esta hoja de cálculo se proporciona para facilitar el análisis. Los valores de intensidad obtenidos con TrackMate se pueden copiar y pegar directamente en la hoja de cálculo para obtener los valores de intensidad nuclear relativa normalizados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table1.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria S2: Ejemplo de los resultados esperados para una condición de control del análisis de LEXY. La hoja de cálculo representa un ejemplo de los valores obtenidos para una condición de control de la línea celular estable de LEXY. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table2.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Uso de las herramientas de optogenética LEXY y LINuS y análisis automatizado de imágenes para cuantificar la dinámica de transporte nucleocitoplasmático en células vivas

Nucleocytoplasmic transport (NCT) is essential for maintaining cellular homeostasis, and its disruption is involved in various diseases, including ...

Nuestro laboratorio estudia la interacción entre los poros nucleares y la organización de la cromatina. Así que estudiamos cómo los poros nucleares afectan la organización de la cromatina, pero también a la inversa si la organización de la cromatina afecta la función de los poros nucleares, especialmente en el transporte nucleocitoplasmático. El transporte nucleocitoplasmático es un proceso muy rápido, por lo que un desafío es detectar cambios en la dinámica del transporte nucleocitoplasmático en células vivas.No hay muchas herramientas disponibles para monitorear el transporte nucleocitoplasmático en células vivas. Mediante la implementación de una técnica semiautomatizada y mejorada, esperamos facilitar el uso de estas herramientas. Nuestro protocolo se basa en el aprendizaje profundo.Limita el error y reduce en gran medida el tiempo necesario para el análisis. Lo que antes tomaría un día ahora solo toma una o dos horas. Para comenzar, inicie el software FIJI en el sistema informático.Seleccione la fase estable como imagen uno, la fase de iluminación como imagen dos y la fase de recuperación como imagen tres. Concatene las tres imágenes que representan tres fases para producir una sola imagen. Guarde la imagen combinada obtenida para la segmentación navegando a Archivo y seleccionando Guardar como TIFF.A continuación, divida el canal mCherry seleccionando Imagen, Color y Dividir canales. Luego guarde la imagen dividida yendo a Archivo, Guardar como y TIFF. Para comprobar si hay decoloración durante la adquisición, seleccione secuencialmente Imagen, Pilas y Trazar perfil del eje Z.Luego haga clic en Datos, seguido de Copiar primer conjunto de datos y péguelo en la hoja de cálculo proporcionada debajo de la celda de perfil del eje Z. Ahora dibuje una región circular de interés, que se aproxime al tamaño promedio de un núcleo, haciendo clic en Analizar, seguido de Herramientas y haciendo clic en Administrador de ROI. Agregue el ROI y guárdelo navegando a Más y haciendo clic en Guardar.Coloque el ROI guardado en una región libre de celdas durante el lapso de tiempo. Asegúrese de que el valor de gris medio esté seleccionado en Analizar y establecer medidas. Luego haga clic en Más, Multi Measure.Marque Medir las 50 rebanadas "y Un ROI por rebanada" y haga clic en Aceptar para registrar la intensidad. Copie y pegue todos los valores de intensidad medidos en la hoja de cálculo proporcionada en la celda de fondo ROI. Luego cierre la imagen solo con el canal mCherry y seleccione la imagen guardada con canales combinados.Ahora abra el complemento TrackMate haciendo clic secuencialmente en Complementos, Seguimiento y TrackMate. Confirme que los puntos de tiempo van de cero a 49 y haga clic en Siguiente. Seleccione el detector StarDist y haga clic en Siguiente.Elija el canal dos, SiR-DNA, para la segmentación de núcleos y espere a que se complete el proceso. Deje los parámetros predeterminados en la ventana de umbral y haga clic en Siguiente. Cree filtros usando Intensidad media, Canal uno, para excluir núcleos con valores de señal extremos.Cree un filtro para seleccionar valores por encima del umbral definido y el otro para seleccionar los valores por debajo del umbral. Del mismo modo, agregue dos filtros de área para eliminar desechos o células moribundas y haga clic en Siguiente. Elija el rastreador LAP simple y haga clic en Siguiente.A continuación, ajuste los parámetros de seguimiento. Establezca la distancia máxima de vinculación en 30 micrómetros, la distancia máxima de cierre de espacio en 15 micrómetros y el espacio máximo de marco de cierre de espacio en tres. Luego haga clic en Siguiente.Después de los cálculos, haga clic en Siguiente para establecer filtros en las pistas. Para seleccionar solo los núcleos de los que se ha realizado un seguimiento durante todo el recorrido temporal, elija el mayor número de puntos del recorrido y haga clic en Siguiente. Luego marque Mostrar nombres de puntos" para volver a trazar cada núcleo en análisis posteriores y personalizar otras características de visualización como prefiera.En la parte inferior de la página, haga clic en Pistas y elija Exportar a CSV" para guardar la tabla de medidas. Cierre la tabla y continúe haciendo clic en Siguiente. Ahora haga clic en Capturar superposición" como acción y luego presione Ejecutar, seguido de Aceptar para generar una imagen con núcleos rastreados.Guarde la imagen haciendo clic secuencialmente en Archivo, Guardar como y eligiendo TIFF. Para importar el archivo CSV de TrackMate a la hoja de cálculo proporcionada, haga clic en la pestaña Datos. En el grupo Obtener datos de transformación, haga clic en Desde texto/CSV" y haga clic en Importar.Copie la columna Spot IDB, Track IDC, Frame I y la intensidad media Channel 1M, y péguelos en las columnas A a D de la hoja de cálculo proporcionada. Ordene los resultados alfabéticamente primero por ID de pista, núcleo individual, de la celda B5, y luego por Marco, punto de tiempo, de la celda C5. Ahora abra GraphPad Prism, cree una nueva hoja y copie y pegue la columna de tiempo de la hoja de cálculo. Luego pegue los valores obtenidos como intensidad nuclear relativa en la tabla GraphPad Prism.Para generar el gráfico de intensidad nuclear relativa, vaya a la sección Gráfico y seleccione XY como familia de gráficos. Luego elija Puntos y línea de conexión con barras de error" como tipo de gráfico. En la configuración del trazado, elija "Media y error" y SEM y haga clic en Aceptar. A continuación, para obtener la tasa de exportación, haga clic en Nueva tabla de datos e ingrese los tiempos en decimales solo para las fases estable e iluminación.Pegue los valores obtenidos como intensidad nuclear relativa para estas fases en la tabla. En la sección Resultados, haga clic en Análisis XY seguido de Exponencial. A continuación, elija Regresión no lineal y haga clic en Aceptar. Seleccione Meseta seguida de un decaimiento de fase" como modelo bajo los parámetros.Luego elija una constante igual a 2.25 como X0, una constante igual a uno como Y0 y una constante igual a cero para la meseta. Indique que K debe ser mayor que cero y presione OK. Cree una nueva tabla y pegue y transponga los valores K obtenidos. En la sección Gráfico, seleccione Columna como familia de gráficos y elija el trazado de violín como tipo de gráfico.Seleccione Mostrar todos los puntos" como gráfico y haga clic en Aceptar. La exportación nuclear con la sonda optogenética lexy se visualizó en imágenes de células vivas. En la condición de control con células tratadas con metanol, la intensidad de mCherry nuclear disminuyó drásticamente después de la iluminación con luz azul, seguida de una recuperación gradual durante la fase posterior a la iluminación. El tratamiento con el inhibidor de exportación, leptomicina B, provocó un cambio en la exportación nuclear, ya que la señal de la sonda se mantuvo consistentemente nuclear en todos los puntos de tiempo.El análisis cuantitativo de la intensidad nuclear relativa mostró con el tiempo una lenta disminución hasta alcanzar una meseta al final de la fase de iluminación. Las concentraciones intermedias de leptomicina B deben mostrar una exportación nuclear leve. Las tasas de exportación calculadas a partir de los datos de intensidad confirmaron una tasa de exportación significativamente mayor en las células tratadas con metanol, una tasa mucho más baja con una leptomicina B nanomolar y casi ninguna exportación con una leptomicina B nanomolar.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Microscopía de una sola molécula approch proporcionan nuevos conocimientos sobre el transporte nuclear.

Imagen de una sola molécula de transporte nuclear

El transporte intracelular de cargas, como vesículas u orgánulos, se lleva a cabo mediante proteínas motoras moleculares que se desplazan por microtúbulos polarizados. Este protocolo describe la correlación de la direccionalidad del transporte de las partículas de carga individuales que se mueven dentro de las neuronas, con la cantidad relativa y el tipo de proteínas motoras asociadas.

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Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un buen modelo para estudiar el transporte axonal e intracelular. Aquí describo un protocolo para el análisis del transporte axonal e intraflagelar en C. elegansy grabación en vivo .

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Aquí describimos un método in vitro de imágenes en vivo para visualizar el transporte intracelular de orgánulos y el tráfico de proteínas de membrana plasmática en astrocitos murinos. Este protocolo también presenta una metodología de análisis de imágenes para determinar los itinerarios de transporte de carga y la cinética.

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Optimización de la visualización del transporte axonal de carga endógena mediante microscopía de fluorescencia en Caenorhabditis elegans vivos

Aprende a utilizar herramientas optogenéticas LEXY y LINuS con análisis automatizado de imágenes para cuantificar la dinámica del transporte nucleocitoplasmático en células vivas. Este protocolo mejora la eficiencia en la investigación de biología celular.

Uso de las herramientas de optogenética LEXY y LINuS y análisis automatizado de imágenes para cuantificar la dinámica de transporte nucleocitoplasmático en células vivas (Video) | JoVE Journal

Uso de las herramientas de optogenética LEXY y LINuS y análisis automatizado de imágenes para cuantificar la dinámica de transporte nucleocitoplasmático en células vivas

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