Uso de las herramientas de optogenética LEXY y LINuS y análisis automatizado de imágenes para cuantificar la dinámica de transporte nucleocitoplasmático en células vivas

Nuestro laboratorio estudia la interacción entre los poros nucleares y la organización de la cromatina. Así que estudiamos cómo los poros nucleares afectan la organización de la cromatina, pero también a la inversa si la organización de la cromatina afecta la función de los poros nucleares, especialmente en el transporte nucleocitoplasmático. El transporte nucleocitoplasmático es un proceso muy rápido, por lo que un desafío es detectar cambios en la dinámica del transporte nucleocitoplasmático en células vivas.

No hay muchas herramientas disponibles para monitorear el transporte nucleocitoplasmático en células vivas. Mediante la implementación de una técnica semiautomatizada y mejorada, esperamos facilitar el uso de estas herramientas. Nuestro protocolo se basa en el aprendizaje profundo.

Limita el error y reduce en gran medida el tiempo necesario para el análisis. Lo que antes tomaría un día ahora solo toma una o dos horas. Para comenzar, inicie el software FIJI en el sistema informático.

Seleccione la fase estable como imagen uno, la fase de iluminación como imagen dos y la fase de recuperación como imagen tres. Concatene las tres imágenes que representan tres fases para producir una sola imagen. Guarde la imagen combinada obtenida para la segmentación navegando a Archivo y seleccionando Guardar como TIFF.

A continuación, divida el canal mCherry seleccionando Imagen, Color y Dividir canales. Luego guarde la imagen dividida yendo a Archivo, Guardar como y TIFF. Para comprobar si hay decoloración durante la adquisición, seleccione secuencialmente Imagen, Pilas y Trazar perfil del eje Z.

Luego haga clic en Datos, seguido de Copiar primer conjunto de datos y péguelo en la hoja de cálculo proporcionada debajo de la celda de perfil del eje Z. Ahora dibuje una región circular de interés, que se aproxime al tamaño promedio de un núcleo, haciendo clic en Analizar, seguido de Herramientas y haciendo clic en Administrador de ROI. Agregue el ROI y guárdelo navegando a Más y haciendo clic en Guardar.

Coloque el ROI guardado en una región libre de celdas durante el lapso de tiempo. Asegúrese de que el valor de gris medio esté seleccionado en Analizar y establecer medidas. Luego haga clic en Más, Multi Measure.

Marque Medir las 50 rebanadas "y Un ROI por rebanada" y haga clic en Aceptar para registrar la intensidad. Copie y pegue todos los valores de intensidad medidos en la hoja de cálculo proporcionada en la celda de fondo ROI. Luego cierre la imagen solo con el canal mCherry y seleccione la imagen guardada con canales combinados.

Ahora abra el complemento TrackMate haciendo clic secuencialmente en Complementos, Seguimiento y TrackMate. Confirme que los puntos de tiempo van de cero a 49 y haga clic en Siguiente. Seleccione el detector StarDist y haga clic en Siguiente.

Elija el canal dos, SiR-DNA, para la segmentación de núcleos y espere a que se complete el proceso. Deje los parámetros predeterminados en la ventana de umbral y haga clic en Siguiente. Cree filtros usando Intensidad media, Canal uno, para excluir núcleos con valores de señal extremos.

Cree un filtro para seleccionar valores por encima del umbral definido y el otro para seleccionar los valores por debajo del umbral. Del mismo modo, agregue dos filtros de área para eliminar desechos o células moribundas y haga clic en Siguiente. Elija el rastreador LAP simple y haga clic en Siguiente.

A continuación, ajuste los parámetros de seguimiento. Establezca la distancia máxima de vinculación en 30 micrómetros, la distancia máxima de cierre de espacio en 15 micrómetros y el espacio máximo de marco de cierre de espacio en tres. Luego haga clic en Siguiente.

Después de los cálculos, haga clic en Siguiente para establecer filtros en las pistas. Para seleccionar solo los núcleos de los que se ha realizado un seguimiento durante todo el recorrido temporal, elija el mayor número de puntos del recorrido y haga clic en Siguiente. Luego marque Mostrar nombres de puntos" para volver a trazar cada núcleo en análisis posteriores y personalizar otras características de visualización como prefiera.

En la parte inferior de la página, haga clic en Pistas y elija Exportar a CSV" para guardar la tabla de medidas. Cierre la tabla y continúe haciendo clic en Siguiente. Ahora haga clic en Capturar superposición" como acción y luego presione Ejecutar, seguido de Aceptar para generar una imagen con núcleos rastreados.

Guarde la imagen haciendo clic secuencialmente en Archivo, Guardar como y eligiendo TIFF. Para importar el archivo CSV de TrackMate a la hoja de cálculo proporcionada, haga clic en la pestaña Datos. En el grupo Obtener datos de transformación, haga clic en Desde texto/CSV" y haga clic en Importar.

Copie la columna Spot IDB, Track IDC, Frame I y la intensidad media Channel 1M, y péguelos en las columnas A a D de la hoja de cálculo proporcionada. Ordene los resultados alfabéticamente primero por ID de pista, núcleo individual, de la celda B5, y luego por Marco, punto de tiempo, de la celda C5. Ahora abra GraphPad Prism, cree una nueva hoja y copie y pegue la columna de tiempo de la hoja de cálculo. Luego pegue los valores obtenidos como intensidad nuclear relativa en la tabla GraphPad Prism.

Para generar el gráfico de intensidad nuclear relativa, vaya a la sección Gráfico y seleccione XY como familia de gráficos. Luego elija Puntos y línea de conexión con barras de error" como tipo de gráfico. En la configuración del trazado, elija "Media y error" y SEM y haga clic en Aceptar. A continuación, para obtener la tasa de exportación, haga clic en Nueva tabla de datos e ingrese los tiempos en decimales solo para las fases estable e iluminación.

Pegue los valores obtenidos como intensidad nuclear relativa para estas fases en la tabla. En la sección Resultados, haga clic en Análisis XY seguido de Exponencial. A continuación, elija Regresión no lineal y haga clic en Aceptar. Seleccione Meseta seguida de un decaimiento de fase" como modelo bajo los parámetros.

Luego elija una constante igual a 2.25 como X0, una constante igual a uno como Y0 y una constante igual a cero para la meseta. Indique que K debe ser mayor que cero y presione OK. Cree una nueva tabla y pegue y transponga los valores K obtenidos. En la sección Gráfico, seleccione Columna como familia de gráficos y elija el trazado de violín como tipo de gráfico.

Seleccione Mostrar todos los puntos" como gráfico y haga clic en Aceptar. La exportación nuclear con la sonda optogenética lexy se visualizó en imágenes de células vivas. En la condición de control con células tratadas con metanol, la intensidad de mCherry nuclear disminuyó drásticamente después de la iluminación con luz azul, seguida de una recuperación gradual durante la fase posterior a la iluminación. El tratamiento con el inhibidor de exportación, leptomicina B, provocó un cambio en la exportación nuclear, ya que la señal de la sonda se mantuvo consistentemente nuclear en todos los puntos de tiempo.

El análisis cuantitativo de la intensidad nuclear relativa mostró con el tiempo una lenta disminución hasta alcanzar una meseta al final de la fase de iluminación. Las concentraciones intermedias de leptomicina B deben mostrar una exportación nuclear leve. Las tasas de exportación calculadas a partir de los datos de intensidad confirmaron una tasa de exportación significativamente mayor en las células tratadas con metanol, una tasa mucho más baja con una leptomicina B nanomolar y casi ninguna exportación con una leptomicina B nanomolar.