Name: Un sistema de cocultivo modificado para comprender las interacciones de las células de la granulosa y la teca en el ovario bovino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende un sistema de cocultivo modificado para estudiar las interacciones entre células de la granulosa y la teca en ovario bovino. Este modelo permite analizar la señalización paracrina y el transporte de sustratos en la dinámica folicular.

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<ol><li>Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+ovarian+follicular+dynamics+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.</a> Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).</li>
<li>Forde, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrous+cycles+in+Bos+taurus+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Oestrous cycles in Bos taurus cattle.</a> Anim Reprod Sci. 124 (3-4), 163-169 (2011).</li>
<li>Hennet, M. L., Combelles, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antral+follicle%3A+A+microenvironment+for+oocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The antral follicle: A microenvironment for oocyte differentiation.</a> Int J Dev Biol. 56 (10-12), 819-831 (2012).</li>
<li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+resource%3A+Preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Research resource: Preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Mol Endocrinol. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li>
<li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell Tissue Res. 354, 869-880 (2013).</li>
<li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tissue+culture+model+of+estrogen-producing+primary+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells.</a> J Vis Exp. (139), e58208(2018).</li>
<li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system%3A+Induction+and+maintenance+of+estradiol+production%2C+response+to+follicle-+stimulating+hormone%2C+and+morphological+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: Induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biol Reprod. 56 (3), 608-616 (1997).</li>
<li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androstenedione+increases+cytochrome+P450+aromatase+messenger+ribonucleic+acid+transcripts+in+non-luteinizing+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Androstenedione increases cytochrome P450 aromatase messenger ribonucleic acid transcripts in non-luteinizing bovine granulosa cells.</a> Mol Reprod Dev. 70, 175-183 (2005).</li>
<li>Chandrasekher, Y. A., Fortune, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oxytocin+on+steroidogenesis+by+bovine+theca+and+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effects of oxytocin on steroidogenesis by bovine theca and granulosa cells.</a> Endocrinology. 127 (2), 926-933 (1990).</li>
<li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biol Reprod. 62 (1), 186-191 (2000).</li>
<li>Gong, J. G., McBride, D., Bramley, T. A., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+recombinant+bovine+somatotrophin%2C+insulin-like+growth+factor-I+and+insulin+on+bovine+granulosa+cell+steroidogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Effects of recombinant bovine somatotrophin, insulin-like growth factor-I and insulin on bovine granulosa cell steroidogenesis in vitro.</a> J Endocrinol. 143 (1), 157-164 (1994).</li>
<li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-lactate+induces+specific+genome-wide+alterations+of+gene+expression+in+cultured+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">L-lactate induces specific genome-wide alterations of gene expression in cultured bovine granulosa cells.</a> BMC Genomics. 20 (1), 273(2019).</li>
<li>Baddela, V. S., Sharma, A., Plinski, C., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+protects+granulosa+cells+from+oleic+acid+induced+steatosis+and+rescues+progesterone+production+via+cAMP+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Biol+Lipids%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid protects granulosa cells from oleic acid induced steatosis and rescues progesterone production via cAMP dependent mechanism.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1867 (8), 159159(2022).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+free+fatty+acids+affect+bovine+granulosa+cell+function%3A+a+molecular+cue+for+compromised+reproduction+during+negative+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Connect%22%5BJournal%5D)">Elevated free fatty acids affect bovine granulosa cell function: a molecular cue for compromised reproduction during negative energy balance.</a> Endocr Connect. 8 (5), 493-505 (2019).</li>
<li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+oestrogen+synthesis+-+The+two-cell%2C+two-+gonadotrophin+model+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Follicular oestrogen synthesis - The two-cell, two- gonadotrophin model revisited.</a> Mol Cell Endocrinol. 100, 51-54 (1994).</li>
<li>Campen, K. A., Lavallee, M., Combelles, C. M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+bisphenol+S+on+bovine+granulosa+and+theca+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Domest+Anim%22%5BJournal%5D)">The impact of bisphenol S on bovine granulosa and theca cells.</a> Reprod Domest Anim. 53 (2), 450-457 (2018).</li>
<li>Glister, C., Richards, S. L., Knight, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+%28BMP%29+-4%2C+-6%2C+and+-7+potently+suppress+basal+and+luteinizing+hormone-induced+androgen+production+by+bovine+theca+interna+cells+in+primary+culture%3A+could+ovarian+hyperandrogenic+dysfunction+be+caused+by+a+defect+in+thecal+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins (BMP) -4, -6, and -7 potently suppress basal and luteinizing hormone-induced androgen production by bovine theca interna cells in primary culture: could ovarian hyperandrogenic dysfunction be caused by a defect in thecal BMP signaling.</a> Endocrinology. 146 (4), 1883-1892 (2005).</li>
<li>Wrathall, J. H., Knight, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inhibin-related+peptides+and+oestradiol+on+androstenedione+and+progesterone+secretion+by+bovine+theca+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Effects of inhibin-related peptides and oestradiol on androstenedione and progesterone secretion by bovine theca cells in vitro.</a> J Endocrinol. 145 (3), 491-500 (1995).</li>
<li>Shores, E. M., Picton, H. M., Hunter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+pig+theca+cell+steroidogenesis+by+LH%2C+insulin-like+growth+factor+I+and+granulosa+cells+in+serum-free+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of pig theca cell steroidogenesis by LH, insulin-like growth factor I and granulosa cells in serum-free culture.</a> J Reprod Fertil. 118 (2), 211-219 (2000).</li>
<li>Gregoraszczuk, E. L., Ptak, A., Karniewska, M., Ropstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+defined+mixtures+of+PCBs%2C+p%2Cp%27-DDT+and+its+metabolite+p%2Cp%27-DDE%2C+on+co-culture+of+porcine+theca+and+granulosa+cells%3A+steroid+secretion%2C+cell+proliferation+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Action of defined mixtures of PCBs, p,p'-DDT and its metabolite p,p'-DDE, on co-culture of porcine theca and granulosa cells: steroid secretion, cell proliferation and apoptosis.</a> Reprod Toxicol. 26 (2), 170-174 (2008).</li>
<li>Rak, A., Drwal, E., Wróbel, A., Gregoraszczuk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistin+is+a+survival+factor+for+porcine+ovarian+follicular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Resistin is a survival factor for porcine ovarian follicular cells.</a> Reproduction. 150 (4), 343-355 (2015).</li>
<li>Kotsuji, F., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+granulosa+and+theca+cell+interactions+in+ovarian+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">The role of granulosa and theca cell interactions in ovarian structure and function.</a> Microsc Res Tech. 27 (2), 97-107 (1994).</li>
<li>Orisaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ovarian+theca+cells+on+granulosa+cell+differentiation+during+gonadotropin-independent+follicular+growth+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Effects of ovarian theca cells on granulosa cell differentiation during gonadotropin-independent follicular growth in cattle.</a> Mol Reprod Dev. 73 (6), 737-744 (2006).</li>
<li>Tajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+granulosa+and+theca+cell+interactions+in+ovarian+follicular+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Role of granulosa and theca cell interactions in ovarian follicular maturation.</a> Microsc Res Tech. 69 (6), 450-458 (2006).</li>
<li>Tajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ovarian+theca+cells+on+apoptosis+and+proliferation+of+granulosa+cells%3A+changes+during+bovine+follicular+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of ovarian theca cells on apoptosis and proliferation of granulosa cells: changes during bovine follicular maturation.</a> Biol Reprod. 66 (6), 1635-1639 (2002).</li>
<li>Allegrucci, C., Hunter, M. G., Webb, R., Luck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+bovine+granulosa+and+theca+cells+in+a+novel+serum-free+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Interaction of bovine granulosa and theca cells in a novel serum-free co-culture system.</a> Reproduction. 126 (4), 527-538 (2003).</li>
<li>Santaguida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+by+side+comparison+between+dynamic+versus+static+models+of+blood-brain+barrier+in+vitro%3A+A+permeability+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: A permeability study.</a> Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolated+Brain+Microvessel%3A+A+Versatile+Experimental+Model+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Isolated Brain Microvessel: A Versatile Experimental Model of the Blood-Brain Barrier.</a> Front Physiol. 11, 398(2020).</li>
<li>Schneider, F., Brüssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reprod Fertil Dev. 18 (8), 857-866 (2006).</li>
<li>Nimz, M., Spitschak, M., Schneider, F., Fürbass, R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+genes+encoding+steroidogenic+enzymes+and+hormone+receptors+in+late+preovulatory+follicles+of+the+cow+coincides+with+an+accumulation+of+intrafollicular+steroids%5BTitle%5D)+AND+%22Domest+Anim+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of genes encoding steroidogenic enzymes and hormone receptors in late preovulatory follicles of the cow coincides with an accumulation of intrafollicular steroids.</a> Domest Anim Endocrinol. 37, 45-54 (2009).</li>
<li>Amsterdam, A., May, J. V., Schomberg, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+insulin+and+follicle-stimulating+hormone+on+biochemical+and+morphological+differentiation+of+porcine+granulosa+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of insulin and follicle-stimulating hormone on biochemical and morphological differentiation of porcine granulosa cells in vitro.</a> Biol Reprod. 39 (2), 379-390 (1988).</li>
<li>Monga, R., Sharma, I., Datta, T. K., Singh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+serum-free+buffalo+granulosa+cell+culture+and+analysis+of+genes+involved+in+terminal+differentiation+from+FSH-+to+LH-responsive+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Domest+Anim+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Characterization of serum-free buffalo granulosa cell culture and analysis of genes involved in terminal differentiation from FSH- to LH-responsive phenotype.</a> Domest Anim Endocrinol. 41 (4), 195-206 (2011).</li>
<li>Bao, B., Garverick, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+steroidogenic+enzyme+and+gonadotropin+receptor+genes+in+bovine+follicles+during+ovarian+follicular+waves%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of steroidogenic enzyme and gonadotropin receptor genes in bovine follicles during ovarian follicular waves: A review.</a> J Anim Sci. 76 (7), 1903-1921 (1998).</li>
<li>Bao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+messenger+ribonucleic+acid+encoding+luteinizing+hormone+receptor%2C+cytochrome+P450+side+chain+cleavage%2C+and+aromatase+are+associated+with+recruitment+and+selection+of+bovine+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Changes in messenger ribonucleic acid encoding luteinizing hormone receptor, cytochrome P450 side chain cleavage, and aromatase are associated with recruitment and selection of bovine ovarian follicles.</a> Biol Reprod. 56 (5), 1158-1168 (1997).</li>
<li>Orisaka, M., Tajima, K., Tsang, B. K., Kotsuji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-granulosa-theca+cell+interactions+during+preantral+follicular+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ovarian.+Res%22%5BJournal%5D)">Oocyte-granulosa-theca cell interactions during preantral follicular development.</a> J. Ovarian. Res. 2 (1), 9(2009).</li>
<li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li>
<li>Kotsuji, F., Kamitani, N., Goto, K., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+theca+and+granulosa+cell+interactions+modulate+their+growth%2C+morphology%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Bovine theca and granulosa cell interactions modulate their growth, morphology, and function.</a> Biol Reprod. 43 (5), 726-732 (1990).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10x Solución salina equilibrada de Hank's HBSS (w Mg/Ca, rojo de fenol)</td><td>Bio& Vender</td><td>BS. L201-10</td><td>disolver en agua ultrapura; ajustar el pH a 7,4 de la solución de digestión (HBSS y HEPES) y realizar una filtración estéril antes de su uso</td></tr><tr><td>Aguja de 18 G, 40 mm, diámetro 1,2 mm</td><td>Roth</td><td>281T.1</td><td>aguja desechable, atajo</td></tr><tr><td>Jeringa de 3 ml (Omnifix Luer)</td><td>Roth</td><td>LY22.1</td><td></td></tr><tr><td>accutasa</td><td>Merck</td><td>Referencia A6964</td><td>sucursal de la empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>anfotericina B (250 &micro; g/ml)</td><td>Bio& Vender</td><td>BS. AB17.01050</td><td></td></tr><tr><td>androstenediona</td><td>Merck</td><td>46033</td><td>utilizamos una solución madre de 10 mM, diluida en etanol al 100 %; sucursal de la empresa: Supelco</td></tr><tr><td>prismáticos Carl Zeiss Technival2</td><td>Carl Zeiss Jena</td><td>no aplicable</td><td>se utiliza junto con la luz incidente Schott KL 1600 LED</td></tr><tr><td>BSA (5%)</td><td>Merck</td><td>Referencia A3311</td><td>sucursal de la empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>colador celular (100 &micro; m tamaño de poro)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3945.100</td><td>Ajuste a tubos de centrifugación de 50 ml</td></tr><tr><td>colágeno R (0,2 %)</td><td>Serva</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa NB8 (10%)</td><td>Nordmark</td><td>S1745601</td><td></td></tr><tr><td>Contenedor de congelación de células CoolCell LX&nbsp;</td><td>Merck</td><td>CLS432002</td><td>producto de Corning</td></tr><tr><td>viales de crioconservación (2 ml)</td><td>TPP Fausto</td><td>TPP89020</td><td></td></tr><tr><td>plato de cultivo, 12 pocillos, fondo plano</td><td>TPP Fausto</td><td>TPP92112</td><td></td></tr><tr><td>plato de cultivo, 24 pocillos, fondo plano</td><td>TPP Fausto</td><td>TPP92424</td><td></td></tr><tr><td>plato de cultivo, 6 pocillos, fondo plano</td><td>TPP Fausto</td><td>TPP92006</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roth</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sin Ca2+, Mg2+</td><td>Bio& Vender</td><td>BS. L182-10</td><td>disolver en agua ultrapura y esterilizar en autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>estradiol, 17b-[2,4,6,7-3H]</td><td>Hartmann Analytik</td><td>ART1555</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal de ternera (FBS Superior stabil)</td><td>Bio& Vender</td><td>FBS. S0615</td><td></td></tr><tr><td>FSH (~7,000 UI/mg; de hipófisis humana)</td><td>Merck</td><td>F4021</td><td>Preferimos usar una solución madre de 2 &micro; g/ml, diluidos en NaCl al 0,9 %; sucursal de la empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>insertos de cultivo celular colgantes (0,4 &micro; m tamaño de poro)</td><td>celdaQART</td><td>9320412</td><td>Al ordenar, tenga en cuenta las diferentes propiedades de los insertos; preferimos una membrana PET transparente para la microscopía de contraste de fase</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Roth</td><td>9105.2</td><td>ajustar el pH a 7,4 de la solución de digestión (HBSS y HEPES) y realizar una filtración estéril antes de su uso</td></tr><tr><td>Holotransferrina (ganado)</td><td>Merck</td><td>T1283</td><td>disolver en agua estéril; sucursal de la empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Mini kit de ARN innuPREP 2.0</td><td>IST innuscreen</td><td>845-KS-2040250</td><td></td></tr><tr><td>insulina (10 mg/ml; del páncreas bovino)</td><td>Merck</td><td>I0516</td><td>disolver en 1x PBS; sucursal de la empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Bio& Vender</td><td>BS. K0283</td><td></td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>Merck</td><td>I1146</td><td>Utilizamos una solución madre de 200 &micro; g/ml, disueltos en 10 mM de HCl y 1x PBS con 1 mg/ml de BSA; sucursal de la empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop 1000</td><td>ThermoScientific</td><td>no aplicable</td><td>Medición de la concentración de ARN</td></tr><tr><td>NEA (100x)</td><td>Bio& Vender</td><td>BS. K0293</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina (10,000 UI/10 mg/ml)</td><td>Bio& Vender</td><td>BS. A2213</td><td></td></tr><tr><td>agua purificada, apta para cultivo celular</td><td>Merck</td><td>W3500</td><td>sucursal de la empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Kit de síntesis de ADNc SensiFAST</td><td>Bioline</td><td>BIO-65054</td><td>suministrado a través del socio de distribución BioCat</td></tr><tr><td>bicarbonato de sodio (7,5%)</td><td>Bio& Vender</td><td>BS. L1713</td><td></td></tr><tr><td>selenito de sodio</td><td>Merck</td><td>S9133</td><td>disolver en agua estéril; sucursal de la empresa: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>termoagitador TS-100C</td><td>Fischer Scientific</td><td>12357627</td><td>se utiliza junto con el bloque HC18 (Cat.-No. 12337627)</td></tr><tr><td>&alfa;-MEM</td><td>Bio& Vender</td><td>BS. F0915</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema de cocultivo modificado para comprender las interacciones de las células de la granulosa y la teca en el ovario bovino

A Modified Co-Culture System for Understanding Granulosa-Theca Cell Interactions in the Bovine Ovary

Aunque los CT y GC se aislaron utilizando técnicas de separación mecánica bien establecidas basadas en la compartimentación folicular, se evaluó la expresión de genes específicos del tipo de célula CYP17A1 y CYP19A1 para eliminar el riesgo de contaminación cruzada. CYP17A1 se expresó exclusivamente en CT recién aislados, mientras que CYP19A1 se expresó predominantemente en GC recién aislados (Figura 2).
El sistema de cocultivo permite la compartimentación de células de teca y granulosa bovinas en lados opuestos de un inserto de membrana, imitando así la organización espacial in vivo. Después de tres días en cultivo, los CT exhibieron una morfología aplanada y alargada a medida que se extendían por la superficie de la membrana del inserto recubierta de colágeno, lo que indica una unión exitosa (Figura 3A). Cuando se cultivaron solos durante todo el período de 9 días, los CT continuaron proliferando y alcanzaron la confluencia el día 9 (Figura 3B). Por el contrario, los GC cultivados solos durante 6 días en la membrana de inserción recubierta de colágeno desarrollaron un fenotipo similar a los fibroblastos, que es característico de los GC in vitro (Figura 3C). Además, como se describió anteriormente, los GC tendían a formar grupos, una característica típica de estas células en cultivo 5,7,31,32. En el sistema de cocultivo, no se observaron diferencias morfológicas aparentes ni en los CT ni en los GC en comparación con sus respectivos monocultivos emparejados en el tiempo (Figura 3D), lo que indica que el entorno basado en insertos mantiene un comportamiento celular normal. Sin embargo, debido a limitaciones técnicas, la evaluación microscópica del cocultivo sigue siendo un desafío, particularmente para distinguir y evaluar la morfología de CT independientemente de las otras células. Para superar estas limitaciones, actualmente se está abordando un protocolo optimizado para la fijación celular de acuerdo con la exploración de estrategias alternativas para la identificación celular en ausencia de anticuerpos específicos de células para inmunotinción.
La funcionalidad del sistema de cocultivo se evaluó mediante el análisis de la producción de hormonas y la expresión de genes marcadores clave para CT y GC33,34, confirmando las funciones esteroidogénicas específicas del tipo de célula. Una comparación entre el monocultivo de GC y el modelo de cocultivo reveló niveles similares de estradiol (E2) producidos in vitro. Sin embargo, como se esperaba, el monocultivo de TC produjo solo cantidades insignificantes de E2, lo que es consistente con la hipótesis de 2-células-2-gonadotropina (Figura 4A)15, que establece que las células de la teca carecen de la capacidad de sintetizar E2 de forma independiente.
Para evaluar aún más la relevancia fisiológica de las condiciones de cultivo, se examinó la expresión de genes marcadores clave33 . De acuerdo con la hipótesis de 2-células-2-gonadotropina, CYP19A1 se expresó predominantemente en GC, mientras que CYP17A1 se detectó principalmente en CT, un patrón observado tanto en condiciones de monocultivo como de cocultivo (Figura 4B, C). En particular, la abundancia de transcripción de CYP19A1 fue mayor en los GC dentro del sistema de cocultivo en comparación con el monocultivo de GC, a pesar de que no se observaron diferencias en las concentraciones de estradiol.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig1.jpg"> 
Figura 1: Representación esquemática de la configuración del cultivo celular. (A) Un diagrama que ilustra la cámara de inoculación hecha a medida, que utiliza un tubo truncado en el inserto invertido para evitar fugas de medios durante el período de cultivo inicial. (B) Cronología del procedimiento experimental: Los TC se cultivaron en el inserto invertido durante tres días para permitir la adhesión. Se volteó el inserto y se sembraron GC en el lado opuesto, seguido de seis días adicionales de cultivo. El estudio comparó los CT y GC cultivados por separado con el sistema de cocultivo TC-GC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig2.jpg"> 
Figura 2: Expresión génica de marcadores específicos del tipo de célula en células de la granulosa y la teca recién aisladas. (A) CYP17A1 se expresó exclusivamente en CT, mientras que (B) CYP19A1 se detectó predominantemente en GC, lo que confirma la especificidad y la pureza inicial de las poblaciones celulares aisladas antes del cultivo. Los datos se presentan como expresión relativa normalizada a la media geométrica de los genes de referencia RPLP0 y TBP. Se muestran las medias y el error estándar de las medias, se probaron los datos para determinar la normalidad y la varianza, los asteriscos indican diferencias significativas (n = 3, prueba t). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig3.jpg"> 
Figura 3: Morfología de las células de teca y granulosa en cultivo. (A) Los CT cultivados durante 3 días se unieron a la membrana del inserto recubierta de colágeno. (B) Los CT crecieron hasta la confluencia después de todo el período de 9 días en el monocultivo. (C) Los GC muestran el fenotipo típico similar a un fibroblasto después de 6 días en cultivo. (D) El cocultivo de CT y GC no muestra diferencias morfológicas aparentes en comparación con los respectivos monocultivos emparejados en el tiempo. Esta imagen se tomó después de 6 días de cultivo de GC y 9 días de cultivo de TC (en el punto final del experimento de cocultivo). Barras de escala 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig4.jpg"> 
Figura 4: Análisis de marcadores funcionales en el sistema de cocultivo. (A) Las concentraciones hormonales de estradiol (E2) confirman la funcionalidad fisiológica del sistema de cultivo celular. (B, C) El análisis de la expresión génica del marcador TC CYP17A1 y el marcador GC CYP19A1 demuestra la identidad y el estado funcional de ambas poblaciones celulares. Se utilizó la media geométrica de los genes de referencia RPLP0 y TBP para calcular la expresión relativa. Se muestran las medias y el error estándar de las medias, se probaron los datos para determinar la normalidad y la varianza, los asteriscos indican diferencias significativas (n = 3, ANOVA de una vía). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Un sistema de cocultivo modificado para comprender las interacciones de las células de la granulosa y la teca en el ovario bovino

A reliable co-culture of granulosa (GCs) and theca cells (TCs) has the potential to facilitate a more comprehensive understanding of the interactions, ...

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Un sistema de cocultivo modificado para comprender las interacciones de las células de la granulosa y la teca en el ovario bovino

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