Microscopía de expansión: Imagen fluorescente de alta resolución con microscopio convencional

Somos biólogos celulares que investigan el papel del microtúbulo y su función asociada en diferentes organismos modelo. Nuestro objetivo es investigar su papel en la organización celular, morfogénesis, ciliogénesis y división. En los últimos cinco años, hemos contribuido a la comprensión de la composición molecular circular, especialmente mediante el uso de microscopía de expansión.

Y con esto, revelamos la característica clave de su ensamblaje y función. Al combinar microscopía de expansión con criofijación, nuestro protocolo permite obtener imágenes de alta resolución preservando la estructura casi nativa del elemento celular, lo que supera la principal limitación de la microscopía de superresolución. Así que la microscopía de expansión es una técnica de bajo coste y fácil de implementar que da acceso a todo el laboratorio a una resolución sobresaliente.

Para empezar, utiliza una jeringuilla y una aguja para llenar cada tubo de cinco mililitros con un mililitro de acetona seca extra bajo una capucha química. Coloca los tubos en posición vertical en una rejilla metálica y ponlos en nitrógeno líquido para congelar. Llena la mitad de una caja de poliestireno de 30 por 30 centímetros de grosor con hielo seco, y luego llena el dewar tipo Vitrobot con nitrógeno líquido hasta que se detenga la evaporación.

Ahora, retira la araña del aparato de inmersión y llena la cámara metálica de inmersión con etano líquido. Espera 10 minutos para que el etano alcance el equilibrio. Luego, coge una funda de 12 milímetros con pinzas finas y dachala con un papel de seda para absorber el resto de medio de la funda.

Sujeta la cubierta hasta la mitad, usando unas pinzas equipadas con un anillo de sujeción compatible con el desatascador criogénico. Coloca las pinzas que sujetan la cubierta en el porta-émbolo criogénico y usa papel Whatman para eliminar cualquier medio restante. Activa el émbolo criogénico para sumergir el abrigo en la solución de etano contenida en la cámara metálica.

Luego, transfiere rápidamente el engobe de cubierta al tubo que contiene acetona congelada. Incubar los tubos que contienen las cubiertas en hielo seco en un ángulo de aproximadamente 45 grados. Coloque el recipiente cerrado sobre un agitador orbital ajustado a 50 a 100 RPM, y agite durante la noche a cuatro grados Celsius para que la temperatura suba gradualmente.

Después, retira la mayor parte del hielo seco de la caja. Continúa la agitación en el agitador orbital durante 45 minutos adicionales para que la temperatura suba de menos 80 grados Celsius a menos 20 grados Celsius. Abre y cierra brevemente cada tubo para liberar la presión interna.

Luego, transfiere cada cubierta a una placa de 12 pozos o a un recipiente adecuado prellenado con solución de etanol 100% preenfriada. Tras una incubación de cinco minutos, rehidratar las cubiertas mediante una serie de etanol graduado. Después de transferir los slips a PBS, colócalos bajo un microscopio.

Usa pinzas finas para rascar suavemente la superficie y orientar todas las cubiertas con el lado derecho hacia arriba. Coloque los cubos en una placa de cuatro pozos llena con 0,5 a un mililitro de solución de 2%acrilamida y 1,4% de formaldehído en PBS. Luego incubar los abrigos en esta solución a 37 grados Celsius sin agitación.

Después, descongela el 10% de APS y la solución de gel sobre hielo durante 10 minutos antes de la gelificación. Prepara una cámara húmeda usando una fina capa de tejido húmedo y parafilm. Luego guárdalo a cuatro grados Celsius.

Después de 10 minutos, coloca la cámara húmeda sobre un bloque frío para usarla durante la gelificación. Ahora, retira las cubiertas de la solución de anclaje proteico y seca el exceso de líquido usando papel de seda en dos pasadas consecutivas. Añadir APS a la solución de gel para alcanzar una concentración final del 0,5% y vórtice durante dos o tres segundos.

Luego, pipetea dos gotas de 35 microlitros sobre el Parafilm en la cámara húmeda y coloca suavemente cada capa sobre una gota, con las células orientadas hacia abajo dentro de la solución gelificante. Transfiere la cámara húmeda a una incubadora a 37 grados Celsius durante 30 a 60 minutos. Para la desnaturalización, utiliza una herramienta de biopsia de 0,4 centímetros de diámetro para extraer las piezas de gel y colócalas en una placa de seis pozos llena con un mililitro de tampón de desnaturalización.

Agita la placa durante 10 a 15 minutos, hasta que los geles se desprendan de las cubiertas, y transfiere las piezas de gel desprendidas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros llenos con un tampón de desnaturalización fresco. Incuba los geles durante 90 minutos a 95 grados Celsius. Tras la incubación, transfiere los geles a agua doble destilada durante 10 minutos para lavarlos.

Mide el diámetro de los geles usando papel milimétrico para evaluar el factor de expansión del gel. Recubre las cubiertas limpias con aproximadamente 200 microlitros de solución de polilisina. Incuba las cubiertas durante una hora a temperatura ambiente y luego lávalas tres veces con agua doble destilada para eliminar el exceso de polilisina.

Después de secar las cubiertas, guárdalas a cuatro grados Celsius hasta su uso adicional. Coloca el gel correctamente orientado, con las células hacia arriba, sobre papel sin pelusa y déjalas secar para eliminar el exceso de agua. Finalmente, monta los geles secos con las células orientadas hacia abajo sobre las cubiertas cubiertas recubiertas de poli-D-lisina.

La criofijación preservó la red mitocondrial en las células RPE1 de forma más eficaz que la fijación de PFA, como demuestra la tinción de éster del NHS y ATP5A, y permitió la resolución de cristas mitocondriales, que no eran visibles con la fijación de PFA. La criofijación resultó en una mejor conservación de los microtúbulos dinámicos, incluidos los microtúbulos citoplasmáticos y astrales en células mitóticas RPE1, en comparación con la fijación de PFA. La criofijación de Trypanosoma brucei preservó mejor la arquitectura de la mitocondria y la estructura celular general en comparación con la fijación de PFA, como se visualizó con TDH y tinción éster del NHS.

Además, la criofijación preservó mejor el retículo endoplásmico que la fijación de PFA basada en la tinción BIP. Se observaron grietas en células RPE1 criofijadas, pero estas no alteraron la ultra estructura de orgánulos, como mitocondrias o microtúbulos. Una criofijación deficiente se indicó por estructuras en forma de burbujas y microtúbulos ondulados, acompañados de pérdida de integridad membranosa.

La calidad de la expansión dependía de la claridad de las soluciones de acrilato de sodio, siendo las soluciones utilizables que aparecían incoloras o ligeramente amarillas y translúcidas, mientras que las inutilizables se veían turbias y naranjas.