Name: Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprende a etiquetar células madre embrionarias y mesenquimales con tintes fluorescentes para su seguimiento in vivo mediante imágenes ópticas. Esta técnica no invasiva permite monitorear la migración celular en estudios longitudinales de medicina regenerativa.

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Este proyecto fue financiado por una subvención Leon J. SEMILLA Thal del Instituto de Medicina Regenerativa de California. Tobias Henning fue financiado por una beca de investigación de la Asociación Alemana de Investigación (DFG, el Excmo 4578/1-2). Queremos reconocer y agradecer Meneses Juanito por sus consejos sobre la cultura de células madre embrionarias humanas.

Etiquetado de las células madre mesenquimales con el colorante fluorescente SABÍA <ol><li> Para comenzar el procedimiento para el etiquetado de las células madre mesenquimales, trypsinize y el recuento de las células para obtener una suspensión con un número determinado de células. </li><li> Tomar las células de la incubadora y aspirar a los medios tradicionales de los frascos que contienen las células que ser etiquetados </li><li> Se lavan las células con 10 ml de Mg / Ca libre de PBS. Aspirar el PBS. El Mg y Ca inhibiría la tripsina, por lo que el uso de PBS sin estos. </li><li> Añadir precalentado tripsina 0,05%, para un frasco T75 usamos 5 ml. Asegúrese de que toda la superficie del frasco está cubierto. </li><li> Se incuba a 37 ° C en la incubadora durante unos 5 minutos. </li><li> Confirmar la separación bajo el microscopio. Si las células todavía se adhieren a la botella, que toca un par de veces y esperar un poco más hasta que la tripsina tiene éxito. </li><li> Ahora, es necesario para neutralizar la tripsina mediante la adición de los medios de comunicación que contiene 10% de FCS. Utilizamos la misma cantidad de medios de comunicación como es la tripsina. </li><li> Pipeta hacia arriba y abajo varias veces para asegurarse de que todas las células se vuelven a suspender en los medios de comunicación. </li><li> La transferencia de la solución de células a un tubo estéril de polipropileno 15 ml tapado. </li><li> Centrifugar a 400 rcf durante 5 minutos. </li><li> Aspirar el sobrenadante asegurando de no perturbar el sedimento celular. </li><li> Resuspender las células en DMEM y proceder con el recuento de células. </li><li> Suspender las células para ser etiquetados con una densidad de 1x10 ^ 6 por ml en medio de cultivo libre de suero (DMEM). </li><li> Todo esto fue la preparación de la suspensión celular. Ahora, está listo para iniciar el etiquetado. </li><li> En primer lugar, añadir 5 l de medio de contraste SABÍA por ml de suspensión celular. </li><li> A continuación, mezclar la solución pipeteando con suavidad. </li><li> Se incuban las células con la solución de etiquetado a 37 ° C durante 20 minutos en un 6-y de bajo apego plato. </li><li> Una vez que el simple incubación es completa, es necesario para transferir la solución de células a un tubo de polipropileno de 15 ml tapado. </li><li> Centrífuga hacia abajo a 400 rcf durante 5 minutos. </li><li> Aspirar el medio de etiquetado, que garantizan no perturbar el sedimento celular. </li><li> Lavan las células con PBS. Pipeta las células arriba y hacia abajo, asegurándose de que para romper el pellet de células. </li><li> Repita los dos últimos pasos dos veces más, así que hay un total de 3 etapas de lavado. </li><li> Contar las células y realizar una prueba de azul tripán para determinar la viabilidad celular. Estos son los protocolos estándar de cultivo celular que no vamos a explicar aquí. </li><li> Sus células están listos para ser captado en imágenes ópticas. </li></ol> Etiquetado de células madre embrionarias humanas con el tinte fluorescente ICG <ol><li> Para comenzar el procedimiento para el etiquetado de células madre embrionarias humanas, prepare el agente de contraste verde de indocianina. Se mezcla con la protamina agente de transfección. </li><li> Mida 1 mg de polvo verde de indocianina. Disolver el polvo de ICG en 100 l de dimetilsulfóxido (DMSO). </li><li> Añadir 400 l de Dulbecco modificado Eagles Medium (DMEM + 10% Becerro de suero fetal) los medios de comunicación a la mezcla y agite bien. Esto da lugar a una concentración final de 2mg/ml de verde de indocianina. </li><li> Añadir la protamina agente de transfección. Protamina actúa como lanzadera para el agente de contraste, por lo que entra en la célula de manera más eficiente. </li><li> Mezcla de sulfato de 5 l de protamina, que se suministra a una concentración de 10mg/ml, con 300 l ICG y 300 l de suero libre de medio Dulbecco modificado Eagles. </li><li> Agite con cuidado la solución de transfección nuevo durante 5 minutos para permitir complejos de forma. </li><li> La solución de etiquetado está listo. </li><li> Aspirar a los medios tradicionales de células madre de 10 mm placa de Petri. </li><li> Añadir 5 ml de pre-calentado suero libre de DMEM. </li><li> Añadir la solución previamente preparada de protamina / ICG a las células. Iniciar la incubación de una hora colocando la cápsula en una incubadora a 37 ° C. </li><li> Después de la incubación, retire el plato de la incubadora y aspirar a la solución de etiquetado. </li><li> Lavar las células de un enjuague el plato con 5 ml de PBS. </li><li> Aspirar el PBS y reemplazar con 5 ml de tripsina 0,25%. Incubar la placa a 37 ° C durante 5 minutos para permitir que tripsinización a ocurrir. Esto ayuda a sacudir el plato un poco de vez en cuando. </li><li> Pipeta suavemente hacia arriba y abajo, para romper las colonias restantes. </li><li> Neutralizar la tripsina mediante la adición de una cantidad igual de KSR al plato. </li><li> La transferencia de la solución de células a un tubo de 15 ml y centrifugar la solución a 400 rcf durante 5 minutos. </li><li> Resuspender las células en los medios de comunicación completa. </li><li> Si todavía hay grupos en este punto, trypsinize y centrifugar de nuevo. </li><li> Una vez que un grupo sin solución de células se logra, aspirar a los viejos medios y resuspender el precipitado en 10 ml de pre-calentado completo los medios de comunicación ESC. </li><li> En este punto, es necesario separar las células de alimentación de ratones de la hESCs. Esto se hace para asegurar que, más tarde, sólo imágenes de las células madre se produce. </li><li> Para ello, la transferencia de the solución de células a un plato de gelatina recubierto de 10 cm. </li><li> Coloque el plato en la incubadora a 37 ° C y dejar que repose durante 45 minutos. Durante este tiempo, asegúrese de no perturbar el plato. Ahora, los alimentadores se adhiere a la cápsula y las células madre no. </li><li> Transferir la solución de la placa de Petri. y ahora tenemos una solución de etiquetado células individuales de células madre embrionarias humanas. </li><li> Las células ahora se puede contar y una prueba de azul tripán se pueden realizar en ellos. </li><li> Las células están listos para ser fotografiado! </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+tracking+with+Gadophrin-2+--+a+bifunctional+contrast+agent+for+MR+imaging%2C+optical+imaging+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).</li>
<li>Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+experimental+arthritis+using+allogeneic+leukocytes+labeled+with+a+near-infrared+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+%26+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe.</a> Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).</li>
<li>Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+with+Optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking with Optical imaging.</a> Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).</li>
<li>Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+multichannel+near+infrared+endoscope+for+mouse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging.</a> Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).</li>
</ol>

La osteogénesis imperfecta es una técnica relativamente nueva de imágenes, basado en la detección de la fluorescencia. La osteogénesis imperfecta es más sensible que las técnicas de imagen radiotrazador basado en, pero no se asocia con cualquier exposición a la irradiación. OI es un medio eficaz de seguimiento de las células de forma no invasiva y repetitiva, lo que ofrece información para la migración de células al sitio de destino. Una de las principales limitaciones de la técnica es la penetración en el tejido limitado de sondas fluoresc...

<table><tbody><tr><td>Verde de indocianina (IR-125)</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41254-1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM con alta glucosa</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Diluir a una concentración final de 0,1 % en PBS</td></tr><tr><td>PBS sin Mg ni Ca</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA al 0,05 %</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA al 0,25 %</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal caracterizado (FCS)</td><td>Reactivo</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Filtro celular (nylon de 40 &amp;mu;m)</td><td>Reactivo</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Reactivo</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Sustituto de suero Knockout</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>β-Mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos aminoácidos no esenciales</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Reactivo</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina 200 mM</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de protamina</td><td>Reactivo</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

 Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Obtención de imágenes ópticas (OI) es una herramienta fácil, rápida y económica para monitorización in vivo de las nuevas terapias con células madre basado. La técnica se basa en el etiquetado ex vivo de células madre con un tinte fluorescente, la inyección intravenosa posterior de las células marcadas y la visualización de su acumulación en órganos específicos o patologías. La técnica presentada demuestra la forma en que la etiqueta de células madre mesenquimales (hMSC) por simple incubación con el colorante fluorescente lipofílicas DID (C67H103CIN2O3S) y la forma en que la etiqueta de células madre embrionarias (células madre) con la FDA aprobó el colorante fluorescente verde de indocianina (ICG). El mecanismo de captación es a través de la adhesión y difusión del colorante lypophilic a través de la bicapa de fosfolípidos de membrana celular. El etiquetado de eficiencia suele mejorar si se incuban las células con el colorante en el medio libre de suero en lugar de incubación en el suero que contienen los medios de comunicación. Además, la adición del sulfato de protamina agente de transfección mejora significativamente la absorción del agente de contraste.

Este video muestra las técnicas para el etiquetado de las células madre embrionarias y células madre mesenquimales con tintes fluorescentes. Esta técnica se puede utilizar para un seguimiento in vivo de las células madre trasplantadas con técnicas de imagen óptico y de las correlaciones histopatológico con microscopía de fluorescencia.

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

La imagen óptica (IO) es una herramienta sencilla, rápida y económica para el monitoreo in vivo de nuevas terapias basadas en células madre. La técnica se basa en ex vivo...

Bienvenido al laboratorio del Dr. Hiku Alge Blink. Queremos agradecer al Instituto de Medicina Regenerativa de California por financiar este proyecto. La marcación de células madre con un agente de contraste fluorescente permite el seguimiento in vivo de células madre trasplantadas in vivo.La imagen óptica posterior de las células madre marcadas permite estudios longitudinales en los que se puede monitorear de forma no invasiva la migración de las células in vivo. Este video le mostrará cómo marcar tanto las células madre embrionarias humanas como las células madre mesenquimales humanas con colorantes fluorescentes. Hola, soy Sophie Boddington del Grupo de Investigación de Agentes de Contraste del Departamento de Radiología de la Universidad de California en San Francisco.Hoy me gustaría mostrarle dos técnicas diferentes para marcar células madre con agentes de contraste fluorescentes. Una para marcar células madre mesenquimales con el colorante fluorescente DID, y otra para marcar células madre embrionarias humanas con endign ingra. Así que permítame comenzar mostrándole nuestra técnica para marcar células madre mesenquimales humanas con DID.Para comenzar el procedimiento de marca

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Para la evaluación de nuevas terapias con células madre es importante no invasiva vía las células inyectadas en vivo. Este video le mostrará cómo etiquetar células madre mesenquimales humanas embrionarias y con los agentes de contraste basados ​​en óxido de hierro en vivo para su posterior RM en vivo.

Etiquetado y hESCs hMSCs con nanopartículas de óxido de hierro para no invasivo en el seguimiento in vivo mediante RM

Con el creciente interés en terapias con células madre, las técnicas de imagen molecular son ideales para el comportamiento de las células madre de seguimiento tras el trasplante. Genes luciferase reportero le han permitido no invasiva, la evaluación repetida de la supervivencia celular, la ubicación y la proliferación in vivo. Este vídeo demuestra cómo realizar el seguimiento proliferación de células madre en un ratón vivo.

In vitro e in vivo de imágenes de bioluminiscencia gen reportero de células estaminales embrionarias humanas

Se describe una técnica para el etiquetado y el seguimiento de las células madre aprobados por la FDA, superparamagnéticas de óxido de hierro (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Esta técnica de imagen celular que utiliza la resonancia magnética (RM) para la visualización, es fácilmente accesible para su seguimiento a largo plazo y el diagnóstico de engraftments células madre con o sin éxito en los pacientes.

Etiquetado de las células madre con Ferumoxytol, uno de nanopartículas de hierro aprobada por la FDA de óxido

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

En este artículo describimos los principios para diseñar y realizar un experimento de trazado de linaje multicolor utilizando ratones R26R-Confetti. Proporcionamos un protocolo específico para el seguimiento de las células epiteliales de la córnea que puede ser modificado para otros tejidos de interés.

Un método para Lineage Tracing de células corneales Uso de Multi-color de los ratones reportero fluorescente

Combinando los enfoques de trasplante de células, marcaje del citoesqueleto y pérdida/ganancia de función, este protocolo describe cómo se puede utilizar la placa precordal prospectiva del pez cebra en migración para analizar la función de un gen candidato en la migración celular in vivo.

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Este protocolo describe un medio eficaz para controlar la persistencia de la célula y la biodistribución de humanas derivados del adiposo células madre mesenquimales (haMSCs) por far-red de la fluorescencia de etiquetado en un modelo de ratas rodilla osteoartritis (KOA) mediante inyección intra-articular (IA).

En Vivo Seguimiento de humanos derivados del adiposo células madre mesenquimales en un modelo de artrosis de rodilla de ratas con tinte fluorescente membrana lipofílica

Utilizando células epiteliales de próstata primarias humanas, informamos de un nuevo método libre de biomarcadores de caracterización funcional de células similares a tallos mediante un ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides. Se describe un protocolo paso a paso para el etiquetado de celdas 2D BrdU, CFSE o Far Red; formación de esferoides tridimensionales; identificación celular similar a un tallo que retiene la etiqueta por inmunocitoquímica; y aislamiento por FACS.

Aislamiento de células similares a tallos de cultivos esferoides tridimensionales

Este protocolo describe estrategias para identificar y enriquecer el estado celular en cultivos primarios de células madre neurales de ratón adulto mediante imágenes de autofluorescencia utilizando i) un microscopio confocal, ii) un clasificador de células activadas fluorescentes para realizar imágenes de intensidad, o iii) un microscopio multifotónico para realizar imágenes de fluorescencia de por vida.

Clasificación del estado de activación de células madre neurales in vitro mediante autofluorescencia

El método de imágenes intravitales descrito aquí utiliza la segunda generación armónica de colágeno y la fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H para segmentar de forma no invasiva un microambiente tumoral no etiquetado en compartimentos tumorales, estromales y vasculares para un análisis en profundidad de imágenes intravitales 4D.

Un enfoque de segmentación sin etiquetas para imágenes intravitales del microambiente tumoral mamario

El incisivo del ratón contiene valiosas células que retienen etiquetas en su nicho de células madre. Tenemos una forma novedosa de detectar y cuantificar de manera imparcial las células que retienen la etiqueta; nuestro estudio utilizó el etiquetado EdU y un enfoque de reconstrucción 3D después de la limpieza del tejido PEGASOS de la mandíbula.

Detección y cuantificación de células que retienen etiquetas en incisivos de ratón utilizando un enfoque de reconstrucción 3D después de la limpieza de tejidos

Aprende a etiquetar células madre embrionarias y mesenquimales con tintes fluorescentes para su seguimiento in vivo mediante imágenes ópticas. Esta técnica no invasiva permite monitorear la migración celular en estudios longitudinales de medicina regenerativa.

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

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