Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas
2 de abril de 2008
Este video muestra las técnicas para el etiquetado de las células madre embrionarias y células madre mesenquimales con tintes fluorescentes. Esta técnica se puede utilizar para un seguimiento in vivo de las células madre trasplantadas con técnicas de imagen óptico y de las correlaciones histopatológico con microscopía de fluorescencia.
Bienvenido al laboratorio del Dr. Hiku Alge Blink. Queremos agradecer al Instituto de Medicina Regenerativa de California por financiar este proyecto. La marcación de células madre con un agente de contraste fluorescente permite el seguimiento in vivo de células madre trasplantadas in vivo.
La imagen óptica posterior de las células madre marcadas permite estudios longitudinales en los que se puede monitorear de forma no invasiva la migración de las células in vivo. Este video le mostrará cómo marcar tanto las células madre embrionarias humanas como las células madre mesenquimales humanas con colorantes fluorescentes. Hola, soy Sophie Boddington del Grupo de Investigación de Agentes de Contraste del Departamento de Radiología de la Universidad de California en San Francisco.
Hoy me gustaría mostrarle dos técnicas diferentes para marcar células madre con agentes de contraste fluorescentes. Una para marcar células madre mesenquimales con el colorante fluorescente DID, y otra para marcar células madre embrionarias humanas con endign ingra. Así que permítame comenzar mostrándole nuestra técnica para marcar células madre mesenquimales humanas con DID.
Para comenzar el procedimiento de marcado de células madre mesenquimales, debemos tripsinizarlas y contarlas para obtener una suspensión con un número definido de células. Dado que esta es una técnica estándar de cultivo de tejidos, no la mostraremos en detalle. Deseamos suspender las células que vamos a marcar a una densidad de 1 millón de células por mililitro en medio de cultivo libre de suero.
Primero, agregamos cinco microlitros de agente de contraste DID por mililitro de suspensión celular. Ahora mezclamos la solución mediante pipeteo suave y las células se incuban con la solución de marcado en una placa de seis pocillos de baja adhesión a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Una vez completada la incubación simple, debemos transferir ahora la solución celular a un tubo cónico de 15 mililitros.
Centrifugamos a 400 RCF durante cinco minutos. A continuación, aspiramos el medio de marcado asegurándonos de no perturbar el precipitado. Ahora lavamos las células con PBS.
Aspiramos y expulsamos las células con la pipeta, asegurándonos de romper la agrupación celular. Repetimos estos dos últimos pasos dos veces más, de modo que tengamos un total de tres pasos de lavado.
Ahora contamos las células y realizamos una prueba de triplicado y azul para determinar la viabilidad celular. Después de determinar la viabilidad celular, sus células ya están listas para ser observadas en el imagenador óptico. Para comenzar el procedimiento de marcado de células madre embrionarias humanas, primero debemos preparar el agente de contraste conocido como verde de indocianina.
Luego lo mezclamos con el agente de transfección conocido como protamina. Para comenzar, pesamos un miligramo del polvo de verde de indocianina y lo disolvemos en cien microlitros de DMSO. Añadimos 400 microlitros de DMEM que contiene 10% FCS a la mezcla y agitamos bien, obteniendo una concentración final de dos miligramos por mililitro de verde de indocianina.
A continuación, agregamos el agente de transfección protamina, que actúa como un vehículo para el agente de contraste, permitiendo que entre en la célula de manera más eficiente. Ahora mezclamos cinco microlitros de sulfato de protamina al 10 miligramos por mililitro con 300 microlitros de ICG y 300 microlitros de DMEM sin suero. Luego agitamos la nueva solución de transfección durante cinco minutos para permitir la formación de complejos.
A continuación, aspiramos el medio antiguo y agregamos 10 mililitros de DMEM PRECALENTADO a las células. Añadimos la solución de ICG con protamina previamente preparada a las células e iniciamos la incubación de una hora colocando la placa en el incubador a 37 grados Celsius. Una vez finalizada la incubación, retiramos la placa del incubador, aspiramos la solución de marcado y lavamos las células enjuagando la placa con cinco mililitros de PBS.
A continuación, las células se tripsinizan durante cinco minutos a 37 grados Celsius. Agitar el recipiente ayudará a desprender las células y suspenderlas. Ahora pipeteamos suavemente hacia arriba y hacia abajo para disgregar las colonias restantes.
Neutralizamos la tripsina añadiendo una cantidad igual de DMEM que contiene 10 % FCS al recipiente. A continuación, transferimos la solución celular a un tubo de 15 mililitros y centrifugamos la solución a 400 RCF durante cinco minutos. Resuspendemos las células en medio completo.
Ahora podemos eliminar los grumos o complejos residuales pasando las células a través de un filtro celular de 40 micrómetros. Una vez que tenemos una solución celular libre de grumos, aspiramos el medio antiguo y resuspendemos el precipitado en medio completo para células madre embrionarias humanas precalentado. En este momento, necesitamos separar las células alimentadoras de ratón de las células madre embrionarias humanas.
Esto se hace para asegurarnos de que posteriormente estemos visualizando únicamente las células madre. Para ello, transferimos la solución celular a una placa de Petri de 10 centímetros recubierta con gelatina. Colocamos la placa en el incubador a 37 grados y la dejamos reposar durante 45 minutos.
Durante este tiempo, asegúrese de no molestar el recipiente. Ahora los alimentadores se adherirán al recipiente y las células madre no lo harán. Transferimos la solución fuera del recipiente de Petri y ahora tenemos una solución etiquetada de células individuales de células madre embrionarias humanas.
Ahora podemos contar las células y realizar una prueba de triplicado con azul de tripan. Tras confirmar la viabilidad, nuestras células están listas para ser observadas mediante imágenes. La diapositiva muestra un ejemplo de cómo se pueden visualizar in vivo las células madre en ratones después de haber sido marcadas con un agente de contraste fluorescente y administradas mediante una inyección IP.
Los escaneos de imagen óptica seriada mostraron una acumulación inicial de las células en los pulmones, seguida de una redistribución en el hígado, la médula ósea de las extremidades y la glándula tiroides. La marca fluorescente también puede utilizarse para la representación directa de células madre trasplantadas en especímenes de histopatología mediante microscopía fluorescente. Acabamos de mostrarle cómo marcar células madre con agentes de contraste fluorescentes al realizar el etiquetado celular.
Es importante recordar que hay que normalizar cada paso. Hacemos esto para garantizar una eficiencia de marcado y viabilidad celular consistentes, de modo que los resultados de diferentes experimentos puedan compararse. Eso es todo.
Gracias por ver este video y mucha suerte con su etiquetado celular.
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Resumen
Este video demuestra técnicas para marcar células madre embrionarias humanas y células madre mesenquimales con colorantes fluorescentes. Estos métodos permiten el seguimiento in vivo de células madre trasplantadas mediante imágenes ópticas, facilitando correlaciones histopatológicas mediante microscopía de fluorescencia.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación con células madre
- Microscopía de fluorescencia
- Imagen óptica
Antecedentes
- Las células madre embrionarias humanas y las células madre mesenquimatosas son fundamentales para la medicina regenerativa.
- El seguimiento de células madre in vivo es esencial para comprender su comportamiento tras el trasplante.
- Los colorantes fluorescentes proporcionan un método no invasivo para monitorear la migración de células madre.
- La imagen óptica permite estudios longitudinales de la dinámica de las células madre.
Objetivo del estudio
- Demostrar la marcación de células madre con colorantes fluorescentes.
- Permitir el seguimiento in vivo de células madre trasplantadas.
- Facilitar el estudio de la migración y el comportamiento de las células madre a lo largo del tiempo.
Métodos Utilizados
- Etiquetado de células madre embrionarias humanas con agentes de contraste fluorescentes.
- Etiquetado de células madre mesenquimales humanas con colorantes fluorescentes.
- Uso de imágenes ópticas para el seguimiento de células madre in vivo.
- Realización de análisis histopatológico mediante microscopía de fluorescencia.
Resultados principales
- Etiquetado exitoso de células madre con colorantes fluorescentes.
- Capacidad demostrada para rastrear la migración de células madre in vivo.
- Proporcionó información sobre el comportamiento de las células madre trasplantadas.
- Facilitó correlaciones histopatológicas mediante microscopía de fluorescencia.
Conclusiones
- La marcación fluorescente es un método eficaz para rastrear células madre.
- Esta técnica mejora la comprensión de la dinámica de las células madre en medicina regenerativa.
- Estudios futuros pueden basarse en estos métodos para desarrollar terapias con células madre mejoradas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La marcación fluorescente no invasiva de células madre permite el seguimiento longitudinal del destino celular y la biodistribución in vivo, apoyando la investigación traslacional y la validación preclínica de terapias basadas en células. Esta capacidad mejora la confianza predictiva sobre la migración, viabilidad y localización específica de las células madre, orientando decisiones tempranas de avance o interrupción en las líneas de desarrollo de medicina regenerativa. Protocolos estandarizados de marcación y adquisición de imágenes facilitan la reproducibilidad y la comparabilidad entre estudios, lo cual es fundamental para el avance de la investigación y desarrollo empresarial.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la visualización directa de la localización y migración de células madre en modelos vivos.
- Apoya la validación funcional de hipótesis sobre la administración y el injerto celular.
- Reduce la ambigüedad mecanicista al proporcionar datos en tiempo real sobre la biodistribución.
- Facilita la selección de candidatos al identificar tempranamente terapias celulares prometedoras.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Establece protocolos estandarizados para la marcación celular y el análisis de imágenes en diferentes estudios.
- Asegura lecturas cuantitativas reproducibles de viabilidad celular y eficiencia de marcación.
- Prepara células marcadas para flujos de trabajo de imágenes in vivo y ex vivo posteriores.
- Permite la evaluación confiable de agentes de seguimiento celular y plataformas de imagen.
Investigación Translacional y Preclínica
- Correlaciona los resultados de imágenes in vivo con puntos finales de biodistribución relevantes para la enfermedad.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de terapias celulares.
- Proporciona datos ajustados al riesgo para tomar decisiones de avance en programas de medicina regenerativa.
- Permite la correlación histopatológica mediante microscopía de fluorescencia de células marcadas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
La marcación fluorescente y la imagen óptica se integran en el continuo desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, conectando la validación temprana de células con estudios traslacionales in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre la migración celular y la localización tisular en modelos vivos.
- Selección: Proporciona resultados de imagen cuantitativos y estandarizados para la comparación entre diferentes condiciones.
- Análisis: Ofrece puntos finales medibles para la viabilidad celular, la eficiencia de marcado y la biodistribución.
- Investigación Traducional: Relaciona la imagenología in vivo con la confirmación histopatológica del destino celular.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo reutilizable para diversos estudios con células madre y técnicas de imagen en múltiples programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la biodistribución y viabilidad de la terapia celular.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de marcado y de obtención de imágenes para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones tempranas de avance o interrupción del desarrollo y reduce el riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de los candidatos a terapia celular.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células madre, marcado y técnicas de imagen óptica.
- Necesita acceso a instrumentación de imagen de fluorescencia e infraestructura analítica.
- Exige una estandarización rigurosa del protocolo para la comparabilidad entre estudios.
- Debe adaptar los protocolos de marcado a diferentes tipos de células madre y agentes de imagen.
- Depende del mantenimiento de la viabilidad celular y la eficiencia de marcado durante todo el proceso.
