Name: Establecimiento de un sistema de cría de trips de chile (Scirtothrips dorsalis Hood) para el cribado de virulencia de hongos entomopatógenos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T15:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Aprenda a establecer un sistema de cría de Scirtothrips dorsalis mediante bioensayo de hoja desprendida en contenedores con agar. Este método optimiza la supervivencia y sincronización del desarrollo larvario para evaluar hongos entomopatógenos.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>#00 alfiler de insecto</td><td>Entosphinx&nbsp;</td><td>DMM0220</td><td>Hecho en el Reino Unido</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 1,5 ml</td><td>Corning incorporado</td><td>MCT-175-C</td><td>Hecho en EE. UU.</td></tr><tr><td>10 &mu; Asa de inoculación L</td><td>NEST Científico</td><td>718201</td><td>Hecho en EE. UU.</td></tr><tr><td>Escalera de ADN III de 100 pb</td><td>Ayuda genética</td><td>DL007</td><td>Hecho en Taiwán.</td></tr><tr><td>2x Mezcla maestra de PCR SuperRed</td><td>Bioherramientas</td><td>TE-SR01</td><td>Hecho en Taiwán</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 6 cm</td><td>Alfa Plus Científico</td><td>16021</td><td>Hecho en Taiwán</td></tr><tr><td>agar-agar</td><td>Bioman Científico</td><td>AGR001.1</td><td>Grado de microbiología</td></tr><tr><td>agarosa</td><td>Bioman Científico</td><td>PB1200</td><td>Hecho en Taiwán</td></tr><tr><td>BioGreen Tampón de gel de ADN seguro</td><td>Bioman Científico</td><td>SDB001T</td><td>Hecho en Taiwán</td></tr><tr><td>Kit de tejido de extracción de alta velocidad Easy DNA</td><td>Fisher Biotec</td><td>ET-100</td><td>https://www.fisherbiotec.com.au/wp-content/uploads/2021/11/FB-EDNA-DNA-Kits-flyer-11Nov21.pdf (Hecho en Australia)</td></tr><tr><td>Imprimación directa: LCO 1490</td><td>Genómica&nbsp;</td><td>PO-PR220919G6</td><td>Secuencia: 5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3'</td></tr><tr><td>GenepHlow Gel/PCR Kit</td><td>Ayuda genética</td><td>DFH300</td><td>http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf</td></tr><tr><td>contenedor de cría de vidrio&nbsp;</td><td>Empresa de equipos de laboratorio Sunshine</td><td></td><td>Tamaño: 35 mm de altura, 45 mm de diámetro interior. Se puede reemplazar por cualquier tamaño similar de vaso de plástico o vidrio.</td></tr><tr><td>hemocitómetro</td><td>Paul Marienfeld</td><td>640030</td><td>Hecho en Alemania</td></tr><tr><td>incubadora</td><td>Punto de acceso</td><td>F740</td><td>Hecho en Taiwán</td></tr><tr><td>cortador de cuero</td><td>Taller Hecho a Mano Real</td><td></td><td><a href="https://shopee.tw/jj891004?categoryId=100636&amp; entryPoint=ComprarPorPDP& itemId=16023929406">https://shopee.tw/jj891004? categoryId=100636& entryPoint=ComprarPorPDP& itemId=16023929406</a></td></tr><tr><td>Termociclador MiniAmp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Referencia A37834</td><td>Hecho en EE. UU.</td></tr><tr><td>microscopio óptico&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>&nbsp; Ci-L</td><td>Hecho en Japón</td></tr><tr><td>pincel de pintura</td><td>Compañía de cepillos Tian Cheng</td><td>4716608400352</td><td>Se puede reemplazar por un pincel de acuarela de punta fina, equivalente a un pincel redondo de tamaño 0 o 1.</td></tr><tr><td>servilleta de papel</td><td>Flor de mayo</td><td>BLS007-8</td><td>Hecho en Taiwán</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>Teléfono: PM-996</td><td>Hecho en EE. UU.</td></tr><tr><td>Mortero de pellets</td><td>Bioman Científico</td><td>GT100R</td><td>Hecho en Taiwán</td></tr><tr><td>Cebador inverso: HCO 2198</td><td>Genómica&nbsp;</td><td>PO-PR220919G6</td><td>Secuencia: 5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3'</td></tr><tr><td>Caldo de dextrosa Sabouraud</td><td>HiMedia</td><td>MH033-500G</td><td>Hecho en India</td></tr><tr><td>microscopio estereoscópico</td><td>Soptop</td><td>SZN71</td><td>Hecho en Taiwán</td></tr><tr><td>Búfer TAE 50X</td><td>Bioman Científico</td><td>TAE501000</td><td>Hecho en Taiwán</td></tr><tr><td>Interpolación 80</td><td>PanReac AppliChem</td><td>142050.1661</td><td>Hecho en Taiwán</td></tr><tr><td>Bolsa con cremallera</td><td>Compañía de plástico Wenchen</td><td>1809000061</td><td>Tamaño: 12 cm de ancho y 17 centímetros de largo. (Hecho en Taiwán)</td></tr></tbody></table>

establecimiento de un sistema de cría de trips de chile (scirtothrips dorsalis hood) para el cribado de virulencia de hongos entomopatógenos

Establishment of a Chilli Thrips (Scirtothrips dorsalis Hood) Rearing System for Virulence Screening of Entomopathogenic Fungi

El diagrama de flujo experimental presentado en este estudio demostró que se pudo establecer el sistema de cría estable de los trips del chile, desde la recolección en campo hasta el tamizaje de virulencia de los aislados de EPF (Figura 1). Aunque la observación morfológica puede distinguir a los trips del chile de otros trips de las flores, el uso de la secuencia parcial de COI como marcador molecular, incluido el tamaño del amplicón de PCR y la secuenciació...

Establecimiento de un sistema de cría de trips de chile (Scirtothrips dorsalis Hood) para el cribado de virulencia de hongos entomopatógenos

The chilli thrips (Scirtothrips dorsalis Hood) is an economically significant pest of ornamental and food crops in Taiwan. Entomopathogenic fungi (EPF) ...

Los trips del chile son una plaga bien estudiada en múltiples cultivos. Nuestra investigación se centra en la mejora del sistema de reproducción de trips del chile y extender sus aplicaciones en la detección de hongos entomopatógenos para futuros experimentos. Estudios recientes se han centrado en la cría masiva de trips del chile en plantas enteras dentro de jaulas. Algunos están explorando alternativas como hojas separadas, pero los métodos claros y detallados aún no están bien descritos.Este estudio estableció un nuevo método de cría masiva de trips basado en hojas desprendidas, que puede garantizar colonias estables de trips del chile. Además, se desarrolló un sistema de bioensayo estable y reproducible para el cribado de la virulencia de hongos entomopatógenos. Este protocolo aborda la falta de un método estandarizado claro para dominar los trips utilizando el disco de hoja, centrándose en mejorar la gestión de la etapa y reducir el uso de recursos.Este protocolo simplifica el control de la etapa de desarrollo, reduce las necesidades de espacio y mano de obra, y proporciona un suministro constante de trips adecuado para bioensayos confiables y a gran escala. Nuestro laboratorio se centrará en optimizar los métodos de cría masiva y aplicar este protocolo a varias especies de trips, mejorando las condiciones ambientales y de manejo para garantizar poblaciones consistentes y saludables para bioensayos. Además, el sistema de cría masiva se puede ampliar para utilizar la prueba de invernadero.Para comenzar, corte las hojas y flores infestadas de trips del chile. Transfiéralos a una bolsa de plástico con cremallera, asegurándose de sellar la bolsa con un poco de aire en el interior para mantener vivas las rasgaduras. A continuación, obtenga un recipiente de cría de vidrio que mida 35 milímetros de altura y 45 milímetros de diámetro interior.Coloque tres capas de toalla de papel circular, cada una de 40 milímetros de diámetro, en el fondo del recipiente. Agregue de 8 a 10 gotas de agua filtrada sobre las toallas de papel para mantener la humedad. Ahora, lave bien una hoja de mango joven.Examínelo bajo un microscopio óptico para verificar si hay huevos de insectos u otra contaminación por insectos. Con un cortador de cuero, corte la hoja de mango en un disco circular de 40 milímetros de diámetro y colóquela sobre la toalla de papel húmeda dentro del recipiente de vidrio. Observe los trips del chile bajo un microscopio óptico con un aumento de 10X.Con un pincel fino, transfiera 10 trips adultos que comprenden cinco machos y cinco hembras al recipiente de cría de vidrio preparado. Luego selle cada recipiente de cría de vidrio con dos capas de Parafilm. Cree aproximadamente 40 pequeños orificios en el Parafilm usando un alfiler de insecto número 0-0 para garantizar una ventilación adecuada.Coloque el recipiente de cría de vidrio sellado en una incubadora durante 48 horas. Observe los tejidos de las hojas bajo un microscopio estereoscópico para confirmar la presencia de huevos que indiquen la posición de los óvulos. Luego coloque un disco de hoja de mango fresco sobre la hoja con huevos y agregue de 8 a 10 gotas de agua filtrada sobre la toalla de papel para mantener la humedad.Para el mantenimiento de los trips, transfiera directamente la hoja que contiene las larvas del primer estadio a un nuevo recipiente de cría de vidrio. Observe los trips del chile a diario. Para la cría masiva de trips del chile, primero recolecte trips adultos hembras de la población mantenida.Transfiera 10 trips hembras adultas a un recipiente de cría preparado para obtener huevos. Luego, transfiera suavemente aproximadamente 120 larvas de primer estadio a un nuevo recipiente de cría de vidrio con un pincel fino. Para la identificación molecular, recolecte un trips de chile adulto en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.Homogeneizar los trips del chile con un mortero de pellets. A continuación, aísle el ADN genómico utilizando un kit comercial según el protocolo del fabricante y amplíe utilizando PCR Master Mix. Comprobar el amplicón de PCR por electroforesis en un gel de agarosa al 1% para verificar el resultado de la amplificación.Elimine la banda objetivo de aproximadamente 658 pares de bases del gel. Realice una búsqueda de voladura en la base de datos del NCBI utilizando parámetros predeterminados para confirmar la identidad de la especie. Para la preparación de hongos entomopatógenos, agregue de dos a tres mililitros de 0.03% Tween 80 a la superficie de un cultivo de hongos de 10 a 14 días cultivado en agar dextrosa de Sabouraud de 1/4 de concentración.Raspe suavemente los conidios con un asa estéril. Transfiera la suspensión fúngica a un tubo de centrífuga limpio de 15 mililitros. Luego homogeneice la suspensión en vórtice a la máxima velocidad.Filtre la suspensión a través de papel de filtro para eliminar los residuos de hyfil y obtener una suspensión de conidios puros. Use un hemocitómetro para verificar la cantidad de conidios bajo un microscopio óptico. Diluir la suspensión para lograr una concentración de 10 a la potencia de 8 conidios por mililitro.A continuación, transfiera la suspensión de conidial a un micropulverizador esterilizado con luz ultravioleta para su posterior aplicación en bioensayo. Recolecte y lave las hojas tiernas de arándanos de una granja de arándanos. Después de secarlos al aire, examine su superficie bajo un microscopio estereoscópico para verificar si hay artrópodos o huevos restantes y retírelos si están presentes.Ahora, corte un disco de hojas de 2,8 centímetros de diámetro con un cortador de cuero. Luego desinfecte el disco de la hoja en una solución de hipoclorito de sodio al 1%. Y tres enjuagarlo dos veces con agua esterilizada para eliminar cualquier residuo de lejía.A continuación, vierta tres mililitros de agar agua al 2,5% en pequeños recipientes de vidrio dentro de una campana de flujo laminar. Luego, transfiera suavemente el lado adaxial del disco de la hoja hacia arriba sobre el agar e insértelo ligeramente para que solo una pequeña porción quede expuesta sobre la superficie. Una vez que el agar se solidifique por completo, considere los recipientes de vidrio listos para el bioensayo.Antes de la aplicación, agite completamente la suspensión conidial. Con un micropulverizador, aplique uniformemente 0,1 mililitros de la suspensión sobre la superficie de cada disco de hoja desde una distancia de aproximadamente 10 centímetros dentro del recipiente de vidrio. Ahora use un pincel fino para transferir larvas de 10 segundos estadios a cada recipiente de vidrio.Selle cada recipiente con dos capas de Parafilm. Cree aproximadamente 30 pequeños orificios para la ventilación en el Parafilm utilizando un alfiler de insecto número 0-0. Luego coloque los recipientes en una incubadora durante siete días.Observe y registre la mortalidad de los trips del chile bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 10X diariamente durante siete días. Mantenga las larvas muertas dentro del recipiente de vidrio para la observación de micosis para confirmar la infección por hongos endopatógenos. Para el bioensayo de hongos entomopatógenos seleccionados, prepare tres concentraciones de suspensiones conidiales.Inocular las suspensiones en diferentes recipientes de cría. Transforme los datos de mortalidad de cada cepa fúngica utilizando una transformación de arcoseno antes de realizar ANOVA unidireccional para determinar diferencias significativas entre los tratamientos. A continuación, calcule los valores de tiempo letal medio y concentración letal mediana mediante análisis de regresión testamentaria.Se observaron claramente las características morfológicas de los trips del chile en varias etapas de la vida, incluida la etapa larvaria temprana, la etapa larvaria posterior y la etapa adulta. La amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa dirigida al gen COI parcial produjo una banda que confirma la identidad de los trips recolectados en el campo como trips del chile. El sistema de cría de hojas separadas apoyó con éxito el establecimiento de colonias de trips del chile con una tasa de supervivencia del 90% observada en el grupo de control durante el período de observación de siete días.Entre los aislados fúngicos entomopatógenos probados, Cordyceps cateniannulata NCHU-213 causó la mayor mortalidad en larvas de trips del chile a los siete días después de la inoculación, seguido de Cordyceps cateniannulata NCHU-298, mientras que Beauveria bassiana mostró menor virulencia. El valor de LT50 de 10 a la potencia de 8 conidios por mililitro de Cordyceps cateniannulata NCHU-213 y Cordyceps cateniannulata NCHU-298 mostró valores similares y exhibió días más cortos que Beauveria bassiana. Se observó micosis visiblemente en cadáveres de trips infectados con aislados de Cordyceps, como se ve en la excrecencia fúngica que cubre sus cuerpos.Se evidenció un aumento de la mortalidad dependiente de la dosis en los trips tratados con Cordyceps cateniannulata NCHU-213 a los cuatro y cinco días después de la inoculación, mientras que la mortalidad más alta del 71,4% se observó a 10 a la potencia de 7 conidios por mililitro después de siete días, seguida del 58,9% a 10 a la potencia de 8 conidios por mililitro, y al 44,4% a 10 a la potencia de 6 conidios por mililitro.

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Investigación

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Biología

Este protocolo se muestran dos métodos de inoculación para introducir el hongo...

Establecimiento de hongos entomopatógenos como endófitos: Hacia Control Biológico Endofítico

Aquí se presentan las diferentes etapas del desarrollo basado en el conocimiento de un micoinsecticida eficaz, incluyendo el aislamiento, la identificación, el cribado y la selección del hongo entomopatógeno "mejor ajustado", Metarhizium anisopliae , para el control de plagas de insectos en la agricultura .

Desarrollo de<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Como Mycoinsecticide: Del aislamiento al funcionamiento del campo

Aquí hay protocolos para recolectar y microinyectar embriones precelulares de saltamontes de maíz con el fin de modificar su genoma a través de la edición del genoma basada en CRISPR / Cas9 o para la adición de elementos transponibles marcados a través de la transformación de la línea germinal.

Microinyección de saltamontes de maíz, Peregrinus maidis, embriones para la edición del genoma CRISPR/Cas9

Aquí presentamos un protocolo basado en el sistema de cebo del gusano de la harina (Tenebrio molitor) que se utilizó para aislar y seleccionar hongos entomopatógenos (EPF) a partir de muestras de suelo. Se utiliza una fórmula efectiva de número de conidios (ECN) para seleccionar EPF altamente tolerante al estrés en función de las características fisiológicas para el control microbiano de plagas en el campo.

Aislamiento y selección de hongos entomopatógenos a partir de muestras de suelo y evaluación de la virulencia fúngica contra plagas de insectos

Las colonias de hongos entomopatógenos se aíslan de muestras de suelo tropical utilizando cebo Tenebrio , cebo Galleria , así como medio artificial selectivo, es decir, agar de dextrosa de papa enriquecido con extracto de levadura suplementado con cloranfenicol, tiabendazol y cicloheximida (medio CTC).

Comparación de métodos para aislar hongos entomopatógenos de muestras de suelo

El presente protocolo describe un método confiable y directo para cultivar, recolectar y detectar Ditylenchus dipsaci.

Cultivo y cribado del nematodo parásito de la planta Ditylenchus dipsaci

Este protocolo describe el ensayo de alimentación obligada para evaluar el efecto potencialmente tóxico de un fitoquímico en las larvas de insectos lepidópteros. Este es un bioensayo de insectos altamente escalable, fácil de optimizar la dosis subletal y letal, la actividad disuasoria y el efecto fisiológico. Esto podría usarse para detectar insecticidas ecológicos.

Desarrollo de un sistema de ensayo de alimentación para evaluar el efecto insecticida de los fitoquímicos en Helicoverpa armigera

Este protocolo presenta un sistema optimizado de bioensayo de hojas sueltas para evaluar la efectividad de hongos entomopatógenos (EPF) contra el pulgón de la mostaza (Lipaphis erysimi (Kalt.)), un insecto partenogenético. El método describe el proceso de recopilación de datos durante los experimentos con placas de Petri, lo que permite a los investigadores medir de manera consistente la virulencia de EPF contra pulgones de la mostaza y otros insectos partenogenéticos.

Evaluación del efecto afidicida de hongos entomopatógenos contra insectos partenogenéticos, pulgón de la mostaza, Lipaphis erysimi (Kalt.)

En este trabajo se presenta un protocolo para la obtención de hongos entomopatógenos a partir de un barrenador forestal de la madera y una forma sustitutiva de evaluar sus actividades entomopatógenas utilizando un insecto modelo de coleóptero. Este método es eficiente y conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatógenos de plagas de insectos perforadores de madera en bosques naturales.

Aislamiento, identificación conductual y evaluación de la patogenicidad de hongos entomopatógenos de un barrenador forestal

Este video muestra las técnicas generales utilizadas para criar Anopheles gambiae en el laboratorio. Los métodos para el cuidado de los mosquitos de laboratorio se ha demostrado en todas las etapas del ciclo de vida del organismo a partir de larvas a pupas a los adultos se alimentan de sangre.

Protocolo para la cría de los mosquitos (A. gambiae)

Aprenda a establecer un sistema de cría de Scirtothrips dorsalis mediante bioensayo de hoja desprendida en contenedores con agar. Este método optimiza la supervivencia y sincronización del desarrollo larvario para evaluar hongos entomopatógenos.

Establecimiento de un sistema de cría de trips de chile (Scirtothrips dorsalis Hood) para el cribado de virulencia de hongos entomopatógenos (Video) | JoVE Journal

Establecimiento de un sistema de cría de trips de chile (Scirtothrips dorsalis Hood) para el cribado de virulencia de hongos entomopatógenos

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