Microscopía de localización por ultrasonido para el mapeo de superresolución de la microvasculatura cerebral de roedores

Nuestra investigación tiene como objetivo caracterizar la arquitectura y el flujo microvascular cerebral, al tiempo que perfeccionamos los métodos de ultrasonido de superresolución. Los desarrollos recientes han optimizado el seguimiento de microburbujas y reforzado las canaletas de procesamiento para crear protocolos más estables para el mapeo vascular de superresolución con ULM. Para empezar, coloca un ratón anestesiado sobre un marco estereotaxico con una almohadilla eléctrica ajustada a 37 grados Celsius.

Aplicando una presión firme pero no dañina, pellizca el dedo del pie o la cola para comprobar la ausencia de reflejos y confirmar la profundidad adecuada de anestesia. Aplica pomada ocular en ambos ojos para evitar úlceras oculares y formación de cataratas durante el procedimiento. Ahora, rapa la cabeza del ratón con un recortador.

Aplica crema depilatoria. Déjalo reposar entre uno y 1,5 minutos como máximo, luego enjuaga bien con agua tibia y sécalo con gasa. A continuación, aplica gel de ultrasonidos centrífugo en la cabeza para asegurar el acoplamiento acústico.

Para la cateterización de venas caudales, utiliza un juego de infusión alado de media pulgada calibre 27 conectado a una aguja de media pulgada calibre 18 con ocho pulgadas de tubería. Acorta el tubo, si es posible, para minimizar el volumen muerto. Gira suavemente la cola del animal 90 grados para exponer las venas laterales de la cola.

Luego asegura la cola con cinta adhesiva para mantener la estabilidad y evitar movimientos durante la cateterización. Ahora, identifica la vena caudal. Para mejorar la visibilidad de las venas, calienta la cola con agua tibia para favorecer la vasodilatación.

Con un dedo, aplica una presión suave en la base de la cola y deslízala hacia el lugar de la inyección en sentido contrario al flujo sanguíneo. Inserta la aguja paralela a la vena con el bisel hacia arriba. Observa el tubo en busca de retroalimentación sanguínea para confirmar la correcta colocación de la aguja.

En el sistema de imagen, lanza el software de adquisición de ultrasonidos funcional y crea una nueva sesión experimental. Ajusta la posición de la sonda de ultrasonido. Ahora, inicia la adquisición de la vista en vivo en el software y ajusta la sonda en tiempo real usando imágenes Power Doppler para centrar el cerebro en la pantalla.

Optimiza los parámetros de imagen, como el contraste y la compresión, para mejorar la calidad de la visualización. Luego, abre el menú Angio 3D en el software de adquisición. Ajusta los parámetros de escaneo para cubrir completamente el cerebro y luego comienza la adquisición del escaneo.

Mantén abierto el software de adquisición y, una vez terminado el Angio 3D, lanza el software IcoStudio para análisis y visualización. Carga el escaneo 3D de Angio para reseñarlo. Accede al panel de registro cerebral y registra el escaneo 3D Angio usando el modo totalmente automático o manual.

Guarda el registro completado como un archivo BPS. Ahora, abre el menú de navegación Brain y desplázate hacia abajo hasta el panel del gestor de Atlas. Utiliza el navegador de árboles padre e hijo para navegar por el atlas cerebral de Allen Mouse y selecciona las regiones anatómicas deseadas para superponer en el panel de tres vistas.

Elige un plano de imagen que se solape con las regiones seleccionadas de interés. En la vista coronal, coloca manualmente dos marcadores para definir la sección de imagen deseada. Luego, haz clic en Posicionamiento BPS para extraer las coordenadas motoras del plano de imagen seleccionado.

Revisa la vista previa de la imagen del escaneo 3D de Angio y haz clic en Copiar coordenadas BPS. Cambia al software IcoScan y abre el panel de sonda Move. Haz clic en Neuronavigation, pega los valores copiados y permite que el sistema alinee automáticamente la sonda con el plano de imagen seleccionado.

Luego, inicia la imagen en tiempo real para confirmar que el plano actual de imagen está alineado con el plano seleccionado previamente. Utilizando una jeringuilla estéril, inyecta cinco mililitros de solución de cloruro sódico al 0,9% en el vial de microburbujas del agente de contraste de ultrasonidos a través del tabique. Agita vigorosamente el vial durante 20 segundos para volver a suspender las microburbujas y asegurar una dispersión uniforme.

Predefine los parámetros de la grabación, incluyendo la secuencia de ultrasonidos, la tasa de fotogramas y la duración total de la grabación. Luego, extraer el volumen deseado de microburbujas para la inyección y comenzar la adquisición. Una vez iniciada la adquisición, inyecta 100 microlitros en ratones usando la dilución adecuada.

Confirma la mejora de contraste en el panel de visualización en vivo. Enjuaga inmediatamente las microburbujas restantes en el volumen muerto inyectando líquido fisiológico en el catéter. Espera a que termine la adquisición y guarda los datos registrados.

Abre el software de Icolab y haz clic en la pestaña de microscopía de localización de ultrasonidos. Luego, haz clic en Calcular mapas ULM para comenzar el flujo de trabajo de procesamiento. Selecciona la carpeta de origen que contiene los datos adquiridos previamente.

Luego, selecciona el archivo de escaneo específico a procesar y ajusta los límites de tiempo de procesamiento según sea necesario. Haz clic en Siguiente para pasar al paso de informe. Establece la ruta de la carpeta de salida para guardar los archivos procesados y configura los parámetros de visualización para las imágenes del informe.

Ahora haz clic en Ejecutar para comenzar a procesar los datos. Una vez completado, se creará un archivo TRK que contiene coordenadas de microburbujas localizadas, junto con archivos TIFF que representan densidad, velocidad y amplitud retrodispersada. Carga el archivo TRK en IcoStudio para empezar a explorar los datos procesados.

Luego, utiliza el panel lateral derecho en IcoStudio para ajustar parámetros de visualización como contraste, compresión y mapa de color para mejorar la representación de los datos. Para establecer el tiempo de integración, ajusta el doble deslizador situado en la parte inferior de la vista principal para definir los fotogramas de inicio y final del análisis. La pestaña de densidad muestra la distribución de las ocurrencias de microburbujas.

Elige entre densidad absoluta y densidad direccional. Después, haz clic en la pestaña de Velocidad para mostrar la velocidad de la microburbuja en milímetros por segundo usando los modos absoluto, direccional, axial y lateral. Ajusta los umbrales de contraste, compresión y velocidad para mejorar la nitidez de la imagen.

Luego explora la pestaña de Amplitud Retrodispersada para ver la reflectividad de las microburbujas, que mejora el contraste y revela estructuras microvasculares y movimiento fuera del plano. Exporta imágenes como PNG de alta resolución o genera archivos TIFF para análisis cuantitativo con tamaño de píxel personalizable. Los mapas de densidad de microburbujas de una rebanada cerebral de rata coronal adquirida con ULM resolvieron tanto grandes vasos como finas estructuras capilares, revelando una topología vascular detallada, incluyendo bifurcaciones y patrones de ramificación.

El mapa de velocidades de la misma sección cerebral mostró un flujo axial direccional claro, con flujo ascendente representando drenaje venoso y flujo descendente correspondiente a la perfusión arterial, consistente con la conocida arquitectura vascular cortical. El mapa de amplitud retrodispersada proporcionaba contraste dependiente de la profundidad y destacaba los recipientes según su posición elevación, útil para segmentar recipientes fuera del plano o de baja amplitud. Los mapas de densidad vascular adquiridos con una diferencia débil en el mismo ratón mostraron una fuerte superposición espacial, confirmando la reproducibilidad de la orientación en el plano coronal mediante el sistema de posicionamiento cerebral.

El análisis cuantitativo de la corteza somatosensorial izquierda entre sesiones mostró distribuciones similares en radio del vaso, velocidad y caudal, demostrando la reproducibilidad de la medición. Se observó una reproducibilidad similar en la región del tálamo izquierdo, con valores consistentes para el radio del vaso, la velocidad y el caudal entre las sesiones de la semana uno y la semana dos. Este trabajo establece que la microscopía de localización por ultrasonido puede producir de forma fiable mapas de superresolución de la estructura y el flujo microvascular in vivo.

Este protocolo cubre la necesidad de un procedimiento estandarizado que permita adquisiciones robustas de ULM en roedores vivos utilizando un sistema de ultrasonido funcional dedicado.