Aclaramiento óptico transitorio mediante moléculas absorbentes para la obtención de imágenes ex vivo e in vivo

Esta investigación tiene como objetivo evaluar e implementar la limpieza de tejidos utilizando moléculas absorbentes como una estrategia no invasiva para mejorar las imágenes biomédicas tanto en tejidos ex vivo como en animales vivos. Hemos demostrado que el colorante alimentario tartrazina se puede utilizar para lograr un aclaramiento óptico rápido y reversible tanto en tejidos como en animales vivos, mejorando significativamente la profundidad y la claridad de las imágenes. Nuestro protocolo aborda una brecha crítica en la reproducibilidad del aclaramiento óptico transitorio mediante la observación de moléculas e incorpora técnicas avanzadas de visualización computacional para mejorar la visibilidad de las características.

Al proporcionar un protocolo detallado para la limpieza de tejidos con moléculas absorbentes, nuestro trabajo ayuda a la comunidad de investigación en biología e imágenes biomédicas en general a aplicar estos métodos en sus propios estudios. Nuestro laboratorio ha estado avanzando en esta tecnología explorando la interacción física entre la luz y el tejido, ampliando la gama de materiales disponibles y desarrollando plataformas de imágenes ópticas optimizadas. Para comenzar, calcule la masa requerida de polvo de colorante de tartrazina para preparar el volumen de solución deseado.

Transfiera la cantidad calculada de tinte en polvo a un frasco de vidrio limpio. Con una pipeta volumétrica, agregue el volumen requerido de agua desionizada al vial para mantener la precisión. Si el tinte no se disuelve completamente a temperatura ambiente, coloque el vial de vidrio en un horno de laboratorio precalentado a 40 grados centígrados durante 10 minutos o hasta que se disuelva por completo.

Luego, agite la solución de tinte durante 30 segundos a un minuto para asegurar una disolución completa. Para el tejido ex vivo, corte un tejido de pechuga de pollo al grosor deseado en una dirección paralela a las fibras de colágeno y limpie el tejido cortado suavemente con agua. Coloque el tejido entre dos portaobjetos de microscopio limpios para medir el grosor.

Presione suavemente los portaobjetos y use un calibre vernier para medir la distancia en el centro del tejido. A continuación, sumerja el tejido en la solución de tinte preparada. Y coloque el recipiente en un agitador orbital y agite a 100 revoluciones por minuto durante 10 minutos.

Retire el tejido de la solución de tinte con unas pinzas limpias. Coloque la muestra entre dos portaobjetos de vidrio transparente y capture imágenes con una cámara digital o científica ajustada a la resolución y el aumento adecuados. Realice el proceso de adquisición de imágenes en un entorno de luz controlada para minimizar la interferencia de luz externa.

Para medir la transmisión óptica, coloque la muestra preparada en un espectrómetro de infrarrojo cercano UV-visible. Asegúrese de que el sistema esté correctamente alineado y que el haz de luz pase a través de la misma región del tejido antes y después del tratamiento con solución de tinte para mantener la consistencia de la medición. Para el procedimiento, coloque al animal anestesiado en una almohadilla térmica templada a 37 grados centígrados.

Con una maquinilla para animales pequeños, recorte el pelaje del área de imagen deseada. Aplique la crema depilatoria en el área recortada durante menos de 60 segundos para eliminar cualquier vello residual y retire inmediatamente la crema. Limpie la piel con toallitas con alcohol para evitar la irritación.

Para preparar la configuración de imágenes, coloque una almohadilla térmica a 37 grados Celsius debajo del animal para evitar la hipotermia. Alinee la fuente de luz y la cámara para capturar imágenes de alta calidad. Use una solución de tartrazina molar 0.65 mezclada con gel de agarosa al 0.3% a 0.4% para la aplicación.

Con un gotero, aplique la solución preparada sobre la piel, ya sea en el vientre o en la cabeza, según el experimento. Deje reposar la solución durante unos segundos para que comience a absorberse. Ahora, con un hisopo de algodón, frote suavemente el área de aplicación para distribuir uniformemente la solución y mejorar la absorción dérmica.

Luego masajee el área suavemente con un hisopo de algodón limpio y aplique más solución según sea necesario. Observe la aparición de puntos rojos anaranjados, que se fusionarán gradualmente en un color uniforme, lo que indica una penetración exitosa del tinte y el inicio del aclarado óptico. Continúe masajeando el área hasta que la piel se vuelva transparente y los órganos internos sean visibles, lo que generalmente toma alrededor de tres a cinco minutos para un área pequeña.

Coloque suavemente un portaobjetos de vidrio o un cubreobjetos sobre la piel para reducir el brillo de la superficie y minimizar los reflejos. Limpie suavemente la solución de tinte de la piel con un hisopo de algodón o un paño suave humedecido con agua. El efecto de limpieza óptica se revertirá y la piel volverá gradualmente a su apariencia opaca original.

Después de apagar la anestesia con gas, permita que el animal recupere la conciencia. Una vez que el animal esté completamente despierto y móvil, devuélvalo a su jaula de origen. En el tejido de pechuga de pollo ex vivo no tratado, los patrones subyacentes no fueron visibles y los datos del espectrómetro mostraron valores de transmisión bajos que disminuyeron con el aumento del grosor del tejido.

Después del tratamiento con una solución de tartrazina de 0,65 molares, los tejidos se volvieron visiblemente transparentes y la cuadrícula subyacente y los patrones del logotipo emergieron claramente. También se observaron aumentos sustanciales en los valores de transmisión en todos los espesores del espectro visible. En ratones vivos, la aplicación de una solución de tartrazina molar 0,65 permitió la visualización de los órganos internos a través de la piel a los pocos minutos del tratamiento, mostrando una transparencia visiblemente mayor en las regiones abdominales.

El aclaramiento óptico del cuero cabelludo permitió la visualización de los vasos sanguíneos cerebrales sin extirpación quirúrgica de la piel, lo que demuestra la eficacia de la técnica para las imágenes cerebrales. El efecto de limpieza fue totalmente reversible. El enjuague del tejido con agua restauró la opacidad y la apariencia normal de la piel regresó en cuestión de horas, con un crecimiento del cabello observado durante varios días.