Microscopía multiarmónica de autofluorescencia simultánea sin etiquetas

La microscopía multiarmónica de autofluorescencia sin etiquetas simultánea, o microscopía SLAM, captura información única en muestras biológicas midiendo interacciones no lineales con la luz. En nuestro laboratorio, utilizamos esta técnica para estudiar la vida y la enfermedad a escala microscópica. Observamos un cambio hacia imágenes multimodales sin etiquetas, que ofrecen información más rica sobre las estructuras y dinámicas celulares y tisulares, al tiempo que evitan la toxicidad y permiten contrastes y correlaciones complementarios entre las modalidades.

Los microscopios no lineales sin etiquetas de última generación adquieren una señal a la vez, con el riesgo de desalineación, daños fotográficos y muchos procesos simultáneos. El SLAM supera estos problemas al permitir un contraste multimodal estrictamente coregistrado, lo que garantiza datos espaciales y temporales confiables. Esta técnica permite la excitación y detección simultáneas de cuatro canales en un microscopio multifotónico.

Uso de fibra de cristal fotónico para ampliar los pulsos de SHG, THG y fluorescencia de dos y tres fotones. SLAM captura información de señalización celular metabólica estructural y dinámica multiplexada sin artefactos de alineación ni etiquetas exógenas, lo que permite un análisis tisular cuantitativo estandarizado. Sus aplicaciones abarcan la biología fundamental, la investigación traslacional y el descubrimiento de biomarcadores en oncología, neurodegeneración y regeneración de tejidos.

Para comenzar, use un espectrómetro o un analizador de espectro óptico para medir el láser después del espejo parabólico y verificar la generación de supercontinuo de la fibra de cristal fotónico. Gire la placa intermedia después del divisor de haz polarizador para optimizar el ancho del supercontinuo. Encienda el autocorrelacionador de microscopía.

En el software, configure el detector en el detector interno y ajuste el rango de escaneo a 5 picosegundos para capturar el ancho completo de la autocorrelación de pulsos. Desbloquee el láser y alinee el autocorrelador con el haz que sale del formador de pulsos hasta que aparezca una señal. Asegúrese de que el obturador 2 esté cerrado.

A continuación, aplique los medios de inmersión adecuados, como agua o aceite, a la lente del objetivo. Coloque el detector externo autocorrelacionador en la platina del microscopio y colóquelo directamente sobre el objetivo. Ahora encienda los espejos del galvanómetro de escaneo para establecer su voltaje en 0.

Abra el obturador y use un objetivo fluorescente para confirmar que el haz llega al detector externo. Configure el detector de autocorrelacionador para que sea el detector externo. Luego ajuste la posición del escenario hasta que aparezca la señal.

Ajuste los coeficientes polinómicos del formador de pulsos para minimizar iterativamente el ancho de pulso medido por el autocorrelacionador. A medida que disminuye el ancho del pulso, reduzca el rango de escaneo en consecuencia para mejorar la precisión y la visualización de la función de autocorrelación. Asegúrese de que la entrada del láser a la fibra de cristal fotónico esté bloqueada y encienda el láser.

Deje que el láser se caliente durante 30 minutos. Verifique que la trayectoria del haz esté libre de obstrucciones, luego coloque un medidor de potencia óptica en la trayectoria del haz justo antes de la fibra de cristal fotónico. Presione el botón Control para abrir el obturador 1 y medir la potencia de entrada.

Vuelva a cerrar el obturador 1. Mueva el medidor de potencia a la salida de la fibra de cristal fotónico después del espejo parabólico. Abra el obturador 1 y use la etapa de entrada de tres ejes para maximizar la potencia de salida.

Deje que la fibra de cristal fotónico se caliente durante 10 minutos, luego maximice la potencia de salida nuevamente usando la etapa de tres ejes y registre la transmisión del PCF. Mueva el medidor de potencia después del filtro de densidad neutra y gire el filtro para ajustar la potencia del láser que llega a la muestra. Multiplique la potencia medida por la transmitancia de la óptica restante para determinar la potencia de la muestra.

Ahora, encienda los galvanómetros y el escenario. Inicie el software de adquisición e introduzca los parámetros de imagen deseados. Coloque la muestra en la platina utilizando el mismo medio de inmersión que se aplicó anteriormente a la lente del objetivo.

Luego apague las luces de la habitación y cierre las cortinas para evitar que entre la luz ambiental. A continuación, encienda las fuentes de alimentación y los amplificadores del detector. Cierre la caja de luz que rodea la platina del microscopio.

Utilice los interruptores de control electrónico para abrir manualmente los obturadores detectores 3-6. En el software de adquisición, presione la opción Haga clic para iniciar la adquisición para comenzar la creación de imágenes SLAM. Ajuste el enfoque del microscopio con la perilla del controlador de platina hasta que la muestra sea claramente visible.

Utilice el joystick del controlador de la platina del microscopio para encontrar el campo de visión deseado. Una vez colocado, haga clic en Detener y restablecer. En la pestaña Guardar, cambie Guardar datos a Sí.

Luego presione la opción Haga clic para iniciar la adquisición y espere a que se complete la imagen. Para manipular la muestra durante la obtención de imágenes, cierre los obturadores del detector y use una linterna o un faro para iluminar. Después de los ajustes, vuelva a la configuración de imágenes.

Para finalizar la adquisición de imágenes, cierre los obturadores del detector, apague los detectores y solo entonces encienda las luces de la habitación. Bloquee el láser con el obturador 1 y, a continuación, apague el láser. Apague los galvanómetros y la etapa y cierre el software de adquisición.

Deseche la muestra de tejido de manera adecuada y limpie la estación de trabajo. Una fibra de cristal fotónico correctamente cortada mostró una cara de extremo plano perpendicular a su eje y una cara limpia. Las fibras de cristal fotónico mal cortadas mostraban cortes en ángulo, caras astilladas y rasguños o escombros pronunciados en la superficie.

El manejo inadecuado o la contaminación dieron como resultado una acumulación visible de suciedad y partículas alrededor de la superficie de la fibra, oscureciendo el patrón del orificio de aire. Un núcleo quemado con regiones oscurecidas indicaba una fibra de cristal fotónico dañada al final de su vida útil. El espectro del supercontinuo abarcó aproximadamente 975-1, 175 nanómetros con una parte superior plana y modulaciones espectrales distintas.

La autocorrelación de pulsos después de la compresión mostró un perfil simétrico con un medio máximo estrecho de ancho completo, lo que indica una buena forma de pulso. Las fuentes de supercontinuo que funcionaban correctamente producían fuertes señales de segundo y tercer armónico. Un supercontinuo estrecho resultó en la pérdida de la intensidad de la señal del tercer armónico mientras se retenía la señal del segundo armónico.

La ausencia de conformación de pulsos redujo drásticamente todas las señales no lineales, produciendo una imagen débil y de bajo contraste. Las imágenes SLAM exitosas del tejido renal ex vivo mostraron distintas estructuras de nefrona con múltiples señales ópticas fuertes, incluida la generación del tercer armónico y la fluorescencia de NADPH. Las fibras de colágeno intersticiales renales fueron identificables a través de fuertes señales de generación de segundos armónicos.

La imagen de la relación redox indicó un metabolismo mitocondrial aeróbico elevado en los túbulos proximales de la corteza renal en comparación con la médula. Un segundo mapa de relación redox confirmó la variación espacial en el metabolismo oxidativo y glucolítico, reforzando el uso diferencial de energía dentro del tejido.