Name: Microscopía multiarmónica de autofluorescencia simultánea sin etiquetas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprende microscopía SLAM sin etiquetas para estudiar tejidos biológicos con contraste multimodal simultáneo. Esta técnica avanzada permite analizar estructuras celulares evitando toxicidad y daño fotográfico en investigación biomédica.

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La microscopía óptica no lineal aprovecha la respuesta de una muestra a la radiación óptica intensa (luz con campos eléctricos mayores de 3 × 103 V / cm) para derivar el contraste de la imagen, donde la polarización inducida (y, por lo tanto, la señal generada) depende de forma no lineal de la intensidad incidente 1,2,3. Debido a que estos múltiples contrastes están mediados por diferentes interacciones luz-materia, la microscopía no lineal proporciona acceso simultáneo a información única sobre la morfología y el paisaje químico de un espécimen 1,2,3. Mientras que las técnicas tradicionales de microscopía que implican una interacción lineal con la luz de iluminación también permiten obtener imágenes cuantitativas, la microscopía no lineal permite un enfoque más multimodal, a menudo con una profundidad de imagen y un corte óptico mejorados, al tiempo que causa menos fotodaño a la muestra4. En el contexto de aplicaciones biomédicas, como la evaluación intraoperatoria de tejidosimilar a la histología 5,6, esta técnica permite el sondeo directo de biomoléculas nativas, lo que facilita investigaciones sin problemas de células vivas sin necesidad de marcadores o modificaciones externas. Este enfoque evita el uso de etiquetas, etiquetas7, moléculas exógenas, proteínas fluorescentes expresadas genéticamente o nanopartículas, que no solo requieren una gran cantidad de mano de obra, sino que también tienen el potencial de alterar la bioquímica nativa de la muestra y afectar negativamente a las células o tejidos diana 8,9,10. Por lo tanto, el microscopio no lineal sirve como una herramienta analítica poderosa y genuina que proporciona imágenes continuas de estructuras microscópicas sin alterar la integridad química y estructural de la muestra. Esta capacidad abre una amplia gama de aplicaciones, que van desde el diagnóstico y el descubrimiento de fármacos hasta la señalización celular y la biología de sistemas.
Los contrastes multifotónicos, como la autofluorescencia de dos fotones (2PAF), la autofluorescencia de tres fotones (3PAF), la generación de segundos armónicos (SHG) y la generación de terceros armónicos (THG), confieren ventajas analíticas en la caracterización de muestras. La 2PAF es generada por flavinas endógenas, siendo el flavina adenosina dinucleótido (FAD) el más abundante en los sistemas biológicos11. 3PAF aprovecha la excitación del infrarrojo cercano para visualizar cromóforos intrínsecos como NAD (P) H y permite imágenes metabólicas al tiempo que evita los problemas de fototoxicidad y atenuación relacionados con los rayos UV12. SHG revela específicamente estructuras moleculares no centrosimétricas como el colágeno fibrilar (tipos I, II y III) y matrices de proteínas 13,14,15,16,17, proporcionando información estructural 1. Por último, THG, sensible a las interfaces y pequeñas características estructurales, sobresale en la obtención de imágenes de distribuciones lipídicas y vesículas extracelulares 18,19,20,21,22.
Cada una de estas señales de contraste ha sido explorada de forma independiente por grupos de investigación, estableciendo el nicho para la microscopía no lineal multifotónica como una herramienta confiable y versátil para aplicaciones biológicas 23,24,25,26. Estos esfuerzos fueron encabezados por los inventores del microscopio 2PAF, quienes aprovecharon su tecnología innovadora para obtener nuevos conocimientos sobre la morfología de los tejidos, el metabolismo celular e incluso las características morfofuncionales de patologías como la enfermedad de Alzheimer y el cáncer23. Su trabajo ha impulsado en última instancia aplicaciones innovadoras en neurociencia 27,28. En los años siguientes, varios investigadores destacaron la sensibilidad del SHG a los cambios en la matriz extracelular, el andamio que proporciona soporte estructural a las células y que sufre alteraciones sustanciales durante la patogénesis del cáncer29. En particular, Campagnola et al.14,24,30,31 demostraron que la microscopía SHG permite la visualización de ensamblajes macromoleculares y supramoleculares, revelando detalles como la disposición, concentración y tipo de colágeno que no son detectables con las técnicas convencionales basadas en fluorescencia. Estos resultados subrayaron el potencial de la microscopía SHG como una herramienta de diagnóstico viable en entornos clínicos. Finalmente, la microscopía THG se aplicó con éxito para visualizar las capas de la retina en roedores a resolución subcelular25, mapear estructuras cerebrales32 y capturar la topografía multiinterfacial de la invasión de células de melanoma33.
Estas implementaciones históricas de microscopía no lineal generalmente involucraron un láser de femtosegundo (fs) de modo bloqueado acoplado a un objetivo de alta apertura numérica (NA) para generar y recolectar las señales no lineales, que luego se dirigieron con un espejo dicroico a un filtro de paso de banda y se recolectaron con un tubo fotomultiplicador (PMT)34. A pesar de implementaciones similares, la mayoría de las aplicaciones se centraron en adquirir solo uno, o, como máximo, dos contrastes, mientras se pasaban por alto los demás. Para aprovechar al máximo el potencial del microscopio multifotónico, Boppart et al. primero implementaron la adquisición secuencial de múltiples contrastes no lineales 21,35,36,37, seguida de su detección simultánea 4,22,38,39,40,41. La técnica resultante, conocida como microscopía multiarmónica de autofluorescencia sin etiquetas simultáneas (SLAM), co-registra espacial y temporalmente las señales no lineales 2PAF, 3PAF, SHG y THG a través de la excitación de un solo disparo y la detección múltiplex, logrando así un poder analítico superior. La colocalización espaciotemporal de estos cuatro canales proporciona datos altamente clasificados y ricos en funciones42 que ofrecen ventajas sobre los datos adquiridos secuencialmente al eliminar los artefactos de movimiento y garantizar un mejor registro de imágenes. En consecuencia, SLAM permite la generación de características compuestas, como las relaciones ópticas de reducción-oxidación, que caracterizan eficazmente las propiedades metabólicas 43,44,45. Además, el análisis combinado de señales a través de modalidades facilita la ingeniería de características adicionales basadas en la correlación y colocalización de canales. Por ejemplo, Shi et al. demostraron la importancia de las características de colocalización de la microscopía SLAM para clasificar con precisión las células de ovario de hámster chino (CHO) utilizadas en la producción farmacéutica42. De esta manera, SLAM sienta las bases para lo que ahora se considera el estado del arte en microscopía multifotónica, allanando el camino para futuros avances en el campo46.
En este protocolo, describimos los componentes clave de un microscopio SLAM (Figura 1) y describimos una metodología paso a paso para su implementación. Esto incluye la generación y conformación de los pulsos de excitación, la preparación de muestras de tejido representativas, los procedimientos de obtención de imágenes y el procesamiento, así como la visualización de los datos resultantes. Al utilizar tecnología comercial y técnicas establecidas, este protocolo es universal, transferible y se puede reproducir fácilmente utilizando sistemas ópticos similares en diferentes laboratorios.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68637/68637fig1v2.jpg"> 
Figura 1: El diseño óptico de un microscopio multiarmónico de autofluorescencia (SLAM) sin etiquetas simultáneas. El láser de femtosegundo emite luz de 1040 nm en pulsos de 370 fs a una tasa de repetición de 10 MHz. La intensidad y la polarización del láser se controlan cuidadosamente antes de bombear un cristal fotónico para generar un supercontinuo. Luego, los pulsos se comprimen con un formador de pulsos y se dirigen a un microscopio de escaneo láser personalizado (caja discontinua). Los espejos dicroicos y los filtros de paso de banda aíslan las señales no lineales generadas por la muestra antes de que sean detectadas por detectores de fotones de alta sensibilidad, como los tubos fotomultiplicadores (PMT) o los fotodetectores híbridos (HPD). El diseño óptico se basa en un sistema descrito anteriormente41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68637/68637fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Etapa de 3 ejes</td><td>ThorLabs</td><td>MAX316</td><td>Terminado.</td></tr><tr><td>Plato de imagen con fondo de cristal de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>Cubreobjetos #0 sin recubrimiento.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21063029</td><td>Glucosa alta, HEPES, sin rojo fenólico.</td></tr><tr><td>Suplementos de medio de crecimiento de células endoteliales</td><td>PromoCell</td><td>C-39210</td><td>Omita el suero fetal para terneros.</td></tr><tr><td>Láser de femtosegundo FemtoTrain</td><td>Espectro-Física</td><td>1040-5</td><td>Potencia promedio: >5.0 W, Energía de pulso: >500 nJ, Longitud de onda: 1040 nm &plusmn; 8 nm, Tasa de repetición: 10 MHz, Ancho de pulso (FWHM): < 220 ss.</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Cytiva</td><td>SH30071.03</td><td>Caracterización de HyClone.</td></tr><tr><td>Pelacables de fibra</td><td>ThorLabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>Flavina adenina dinucleótido sal disódica hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6625</td><td></td></tr><tr><td>Espejos galvanómetros</td><td>Tecnología de Cambridge</td><td>6215H</td><td>Terminado.</td></tr><tr><td>Estación de trabajo de procesamiento de vidrio</td><td>Vytran</td><td>GPX3800</td><td></td></tr><tr><td>ImagenJ</td><td>Laboratorio de Eliceiri en la Universidad de Wisconsin Madison</td><td>Versión 2.16.0</td><td>Distribución FIJI.</td></tr><tr><td>Papel de seda Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark Profesional</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Cytiva</td><td>SH30034.01</td><td></td></tr><tr><td>Platina de microscopio</td><td>Instrumentación científica aplicada</td><td>FTP-2050</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de platina de microscopio</td><td>Instrumentación científica aplicada</td><td>MS-2000-500-UDSW</td><td></td></tr><tr><td>Autocorrelacionador de microscopía</td><td>Angewandte Physik und Elektronik GmbH</td><td>Carpe</td><td></td></tr><tr><td>Lente del objetivo</td><td>Olimpo</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>Inmersión en agua, aumento de 25X, 1.05 NA.</td></tr><tr><td>Medidor de potencia óptica</td><td>Newport</td><td>919P-003-10</td><td>600 - 1700 nm.</td></tr><tr><td>Analizador de espectro óptico</td><td>ThorLabs</td><td>OSA202C</td><td></td></tr><tr><td>Fibra de cristal fotónico</td><td>Fotónica NKT</td><td>LMA-PM-15 NKT</td><td>Gran área de modo, mantenimiento de polarización. Diámetro del núcleo: 15 &micro;m.</td></tr><tr><td>Cortadora de fibra óptica de precisión</td><td>Fujikura</td><td>CT-101</td><td></td></tr><tr><td>Modelador de pulsos</td><td>Soluciones biofotónicas Inc.</td><td>FemtoJock-D</td><td>Terminado.</td></tr><tr><td>&beta;-Dinucleótido de nicotinamida y adenina, reducido en hidrato de sal disódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10128023001</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopía multiarmónica de autofluorescencia simultánea sin etiquetas

Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic Microscopy

El complejo enfoque multicanal y multimodal del microscopio SLAM (Figura 1) puede dificultar que los nuevos usuarios solucionen problemas y comprendan los resultados. Primero, un PCF bien cortado presenta una cara limpia (Figura 2C) con una superficie plana que es perpendicular a la longitud del PCF (Figura 2A). Una cara de hendidura en ángulo y astillada (Figura 2B) y la presencia de rasguños (<strong ...

Microscopía multiarmónica de autofluorescencia simultánea sin etiquetas

Nonlinear optical microscopy images biological samples by detecting signals from the nonlinear interaction of ultrashort laser pulses with endogenous ...

simultaneous-label-free-autofluorescence-multi-harmonic-microscopy

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Demostramos el uso de la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) para obtener imágenes simultáneas de múltiples tipos de moléculas marcadas con fluorescencia dentro de las células. Las técnicas descritas producen la localización de miles a cientos de miles de proteínas individuales marcadas con fluorescentes, con una precisión de decenas de nanómetros dentro de células individuales.

Imágenes Multicolor Simultáneas de Estructuras Biológicas con Microscopía de Localización de Fotoactivación de Fluorescencia

Se presenta un alto contenido de código abierto instrumento de análisis (HCA) que utiliza imágenes de vida de fluorescencia automatizado (Flim) para ensayar las interacciones proteína utilizando Förster transferencia de energía resonante (FRET) lecturas basadas. La adquisición de datos para este instrumento openFLIM-HCA es controlado por el software escrito en μManager y se lleva a cabo el análisis de datos en FLIMfit.

Open Source de análisis de contenidos de alta Utilizando microscopía de fluorescencia automatizado de imágenes por vida

Aquí, presentamos un protocolo para la localización de varios color de proteínas de membrana único en organelos de células vivas. Para colocar fluoróforos, se usan proteínas auto etiquetadas. Proteínas, situadas en compartimientos diferentes membranas de la mismo orgánulo, se pueden localizar con una precisión de ~ 18 nm.

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Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

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Microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación para discriminar eficientemente las señales de fluorescencia

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Sin contacto, libre de marca Seguimiento de células y matriz extracelular utilizando espectroscopia Raman

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Microscopía multiarmónica de autofluorescencia simultánea sin etiquetas

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