Explorando las interacciones proteína-glicano: avances en la resonancia magnética nuclear

Estudiamos las interacciones proteína-proteína y proteína-glicano, centrándonos en el complejo integrina-desintegrina. Nuestro modelo explora la dinámica estructural y destaca el papel de la fuerza superficial en la mediación de la formación compleja y la estabilidad de la interacción. Nuestro grupo se dedica al estudio del papel de las fuerzas superficiales en el reconocimiento molecular y la evolución de los sitios de unión mediante el estudio de grupos hidrófobos superficiales presentes en proteínas.

La solución de RMN permite la detección de interacciones proteicas. Aunque las interacciones débiles son esenciales para la vida, existe un sesgo hacia los complejos de alta afinidad, a pesar de que están presentes en muchas funciones biológicas importantes. Nuestro grupo se centra en el uso de enfoques de biología estructural integrativa para estudiar grandes complejos de proteínas.

Estamos utilizando la RMN como la principal herramienta para estudiar la dinámica y los aspectos funcionales. Para comenzar, prepare una solución de cuatro milimolares de D-manosa en tampón de fosfato de sodio a pH 7.4 con cloruro de sodio 50 milimolares y óxido de deuterio al 5%. Divida la solución en dos muestras, una que contenga 80 CVN micromolares y la segunda sin ellos.

Para mapear la unión del ligando a través de la perturbación del cambio químico en el espectrómetro de RMN, configure la secuencia de pulsos HSQCTOPSI para la adquisición de H1C13 HSQC. Configure el dominio del tiempo, el ancho espectral, la frecuencia portadora y el número de exploraciones. Calcule la perturbación del desplazamiento químico utilizando la ecuación proporcionada.

Para mapear la unión de ligandos a través de la diferencia de transferencia de saturación, primero, cree un nuevo conjunto de datos. Configure los parámetros para los experimentos de RMN STD examinando diferentes frecuencias de saturación o fijando la frecuencia mientras varía los tiempos de saturación para evaluar la acumulación. Configure experimentos de RMN 1D H1 utilizando la secuencia de pulsos ZGPR.

Ajuste el espectrómetro para H1, realice calzas y mida un pulso duro de 90 grados. Centre la frecuencia portadora aproximadamente en 4,7 partes por millón, correspondiente a la señal de agua, luego seleccione el STDDIFFESGP. 3 y ajuste los parámetros de adquisición.

Establezca el ancho espectral según sea necesario, el retraso entre barridos D1 en cuatro segundos y defina el tiempo de saturación D20, según los objetivos del experimento. Cargue la lista FQ2 con frecuencia fuera de resonancia a menos 40 partes por millón y frecuencias en resonancia solo para saturar proteínas. Pruebe las frecuencias de resonancia de menos 0,59, 0,73 y 8,1 partes por millón para determinar las condiciones óptimas.

Utilice la frecuencia óptima para adquirir espectros STD en tiempos de saturación de 0,5, uno, 1,5, dos, 2,5, tres y cuatro segundos. Grafique los valores ASTD correspondientes en función del tiempo de saturación. Ahora, establezca el número de escaneos en 64 y promedie el bucle del experimento cuatro veces.

A continuación, calcule el número total de escaneos. Establezca el retraso entre escaneos en cuatro segundos y el tiempo de adquisición en 2,7262976 segundos. Configure el pulso de saturación ajustando la duración a 50 milisegundos y el control de la forma gaussiana a través del programa de forma 9SP9.

Aplique un filtro de fila T1 en la variante de RMN STD, luego, establezca el tiempo de bloqueo de giro D29 según el tamaño de la proteína. Para asignar el ligando H1 R2, primero seleccione el programa de pulso CPMG_ESGP2D de la biblioteca estándar de Bruker. Establezca el experimento como una adquisición 2D.

Configure los parámetros de adquisición como se muestra. Luego, ejecute el experimento durante 200 ciclos de ocho escaneos cada uno. Ajuste la lista de contadores variables de acuerdo con el tiempo total deseado del ciclo de CPMG.

Realice dos experimentos, uno para la muestra con la proteína y otro para la muestra solo de ligando. Grafique los espectros H1 para cada TCPMG usando el comando EFP o seno M seguido de FP, luego ajuste la función de ventana de acuerdo con la mejor estrategia de procesamiento. Calcula el cociente CPMG Q usando la ecuación.

Adquiera H1N15HSQC espectros de CVN marcados con N15 a 298 Kelvin. Valorar con D-manosa para alcanzar las concentraciones finales de cero, uno, dos, cinco, 10, 20, 40 y 60 milimoles. Utilice la secuencia de pulsos HSQC rápida FHSQCF3GPPH sensible a la fase de la biblioteca estándar de Bruker.

Luego, calcule la perturbación del cambio químico usando la fórmula. Grafique los valores de CSP para cada residuo en función de la concentración de D-manosa para determinar la constante de disociación KD usando la ecuación cinco. Luego, ajuste los datos resultantes a una sola isoterma de unión usando la fórmula.

Utilice la secuencia de pulsos HSQCT2ETF3GPSI3D sensible a la fase y configure los parámetros que se muestran para medir los valores N15 R2 de los residuos individuales de residuos CVN en ausencia y presencia de 60 milimolares de D-manosa a 298 Kelvin. Procese espectros pseudo-tridimensionales utilizando NMRPipe para generar espectros similares a HSQC para cada retardo de relajación. Importe los espectros procesados a una plataforma de análisis.

Luego, seleccione todos los espectros y aplique la herramienta de seguimiento de cambios de intensidad. Grafique la intensidad de cada pico cruzado en función de T relax y ajuste la desintegración a una función monoexponencial para extraer los valores de N15 R2 para cada residuo. Calcule el error experimental a partir de la relación señal-ruido de los espectros similares a HSQC en 67,84 milisegundos.

Procese una región del espectro que contenga solo ruido y conviértala en un archivo de texto usando el comando dado. Luego, determine la desviación estándar de la región de ruido o la intensidad del ruido utilizando un software estadístico. Calcule el error experimental usando la ecuación dada.

Se observaron perturbaciones de desplazamiento químico para ambas formas anoméricas de D-manosa en presencia de CVN, con mayores cambios observados en la beta-D-manosa, lo que indica una unión preferencial. Se observaron dos picos distintos para la mayoría de los hidrógenos D-manosa en presencia de CVN, correspondientes a estados libres y ligados. Los núcleos de hidrógeno que exhibieron los valores más altos de ASTD se asociaron con beta-D-manosa, consistentes con fuertes interacciones bipolares con CVN.

En el análisis de la tasa de relajación transversal, H beta cuatro fue el único protón que exhibió un aumento notable en la relajación al unirse a CVN. Las perturbaciones del cambio químico H1 y N15 inducidas por la adición de un ligando fueron más altas en concentraciones de hasta 10 milimolares. Los residuos I40, E41, N42, V43, D44 y G45 dentro de la hebra beta mostraron perturbaciones de cambio químico significativas, identificándolos como el sitio de unión de alta afinidad para la D-manosa.

Las isotermas de unión mostraron que el residuo D44 tenía la mayor afinidad entre los residuos de la hebra beta, con una constante de disociación de aproximadamente un milimolar. La medición de las tasas de relajación de N15 R2 mostró aumentos y disminuciones en los valores de delta R2 tras la unión de D-manosa, lo que sugiere una combinación de procesos de estabilización conformacional e intercambio. Los residuos C58, R59, K74 y R76 demostraron un aumento de los valores delta R2, lo que confirma su participación en el sitio de unión de alta afinidad, mientras que los residuos F4, C8, R24 y G27 representaron la región de baja afinidad.