Linfodenectomía mesentérica murina por alteración selectiva de la comunicación linfática con el intestino específico de la región

Nuestra investigación se centra en las respuestas de las células T a los neoantígenos y tejidos periféricos, y estas respuestas están fuertemente influenciadas por el cebado, por lo que nos centramos principalmente en dónde ocurren estos eventos de cebado. Actualmente, las únicas opciones ampliamente utilizadas para bloquear el tráfico entre ganglios linfáticos y tejidos son modalidades sistémicas como los agonistas de los receptores S1P y el bloqueo de integrinas. Pero esta amplia inhibición nos impide estudiar la contribución de ganglios linfáticos locales específicos.

Nuestro protocolo proporciona una descripción detallada de las linfadenectomías altamente selectivas en cada una de las cuatro principales estaciones de ganglios linfáticos mesentéricos, y dado que estos ganglios están bastante especializados en el segmento intestinal que drenan, este procedimiento de supervivencia bien tolerado nos permite alterar segmentos específicos del eje linfático intestinal dejando intacto el resto. Tras confirmar la profundidad anestésica adecuada mediante un pellizco en la pata trasera, se utilizan tijeras quirúrgicas estériles para hacer una incisión cutánea media de 0,5 a 1 centímetro en el ratón anestesiado. Con pinzas estériles, disecciona la piel alejándolo de la pared abdominal e identifica la línea alba.

Luego realiza otra incisión de 0,5 a 1 centímetro a través de la línea alba para acceder a la cavidad peritoneal. Con una aguja de punta roma, inyecta un mililitro de solución salina estéril a temperatura corporal en la cavidad peritoneal. Humedece las cortinas estériles para prepararlas para la colocación intestinal.

Para resecar la primera estación ganglio linfático, orientar el intestino exteriorizado sobre cortinas húmedas, con el ceco posicionado hacia abajo, el colon proximal superior y el íleon terminal hacia el cirujano. Identifica la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos que recorre longitudinalmente el colon. Utilizando pinzas de punta fina en ángulo, disecciona de forma directa la primera estación ganglionar linfática alejada de los vasos ileocólicos colocando las pinzas cerradas entre estas estructuras y abriéndolas suavemente.

Para reducir el riesgo teórico de flujo colateral hacia los ganglios cercanos, realizar una ligadura opcional con suturas interrumpidas simples a lo largo de la cadena ganglionada, un milímetro distal y un milímetro proximal a la primera estación ganglional, utilizando sutura monofilamento de nylon y pinzas de punta fina. Retrae suavemente la estación ganglionaria de forma caudal y, con tijeras de punta fina, extirpa la estación ganglio objetivo desde la cefálade hasta la caudal. Observa las ramas distales de los vasos ileocólicos, ileales y jeyunales para confirmar que el suministro sanguíneo permanece intacto.

Para resecar la segunda estación gangliona, eviscerar suavemente el intestino delgado y orientar el intestino exteriorizado sobre cortinas húmedas, con el ceco posicionado hacia abajo, colon proximal superior y intestino delgado hacia la derecha del cirujano. A continuación, identifica la segunda estación ganglio linfático que recorre longitudinalmente el colon y comienza en la confluencia de los vasos ileal y jeyunal. Utilizando pinzas de punta fina en ángulo, disecciona de forma directa la segunda estación ganglio linfático alejada de los vasos colónicos.

Para reducir el riesgo teórico de flujo colateral hacia los ganglios cercanos, realiza una ligadura opcional con suturas interrumpidas a lo largo de la cadena ganglionada, un milímetro distal y un milímetro proximal a la segunda estación ganglional, utilizando sutura monofilamento de nailon y pinzas de punta fina. Retrae suavemente la estación ganglio linfático caudalmente y, con tijeras de punta fina, extirpa la segunda estación ganglionaria desde la dirección cefálada hasta la caudal. Inspecciona el campo operatorio para asegurar la hemostasis.

Para resecar la cuarta estación ganglio linfático, eviscera suavemente todo el intestino delgado hasta el punto posterior de anclaje. Orienta el intestino sobre drapeados húmedos con el ceco hacia abajo, el colon proximal hacia arriba y el intestino delgado hacia la derecha del cirujano. Identifica la cuarta estación ganglio linfático, que se encuentra justo medial al colon distal y lateral a la tercera estación.

Utilizando pinzas de punta fina en ángulo o tijeras de punta extrafina, disecciona de forma directa la estación del cuarto ganglio linfático alejándose de los vasos colónicos y el tejido adiposo circundante. Para reducir el riesgo teórico de flujo colateral hacia los ganglios cercanos, realizar una ligadura opcional con suturas interrumpidas individuales en cada ganglio linfático identificable, normalmente a un milímetro del ganglio, utilizando sutura de nylon monofilamento y pinzas de punta fina. Luego retrae suavemente la cuarta estación ganglio linfático, cefalada.

Con tijeras de punta fina o extrafina, extirpa las estaciones ganglionales desde caudal hasta cefalada. Repite el procedimiento para el segundo ganglio en la estación del cuarto ganglio linfático. Disecciona cuidadosamente el nodo, realiza la ligadura con sutura si es necesario y resecátalo.

Inspecciona el campo operatorio para confirmar hemostasis. Tras devolver el contenido abdominal a la cavidad peritoneal, inyectar un mililitro de solución fisiológica estéril a temperatura corporal en la cavidad abdominal para compensar la pérdida de líquido evaporativo. Cierra el abdomen en dos capas: primero la pared abdominal y luego la piel usando una sutura de polipropileno monofilamento 6-0 en un patrón de corrida.

El tejido extraído mediante el procedimiento de linfadenectomía mesentérica resultó consistentemente en muestras con bajo contenido de adiposo, como se evidencia por el hundimiento inmediato en PBS. El análisis de citometría de flujo confirmó la extracción exitosa de ganglios linfáticos, con más del 95% de las células en muestras derivadas de la linfadenectomía mesentérica identificadas como CD45 positivas, frente a solo el 7% en controles viscerales del tejido adiposo.