Edición mejorada del genoma a través de la técnica de electroporación in vivo basada en la administración de ácidos nucleicos oviductales para la generación de ratones knockout

El alcance de nuestra investigación es simplificar la generación de ratones knockout mediante electroporación in utero, que introduce componentes de edición genómica directamente en los oviductos de las hembras embarazadas. Las microinyecciones en cigotos requieren mantener un gran número de animales, incluyendo hembras donantes y receptoras, y machos vasectomizados. Por lo tanto, son preferibles protocolos que minimicen el uso de animales.

El uso del sistema Nepa21 para la electroporación de cigotos ofrece una oportunidad única para generar ratones knockout génicos dirigidos en un solo paso, con una eficiencia comparable a las técnicas estándar basadas en inyección nuclear. Para empezar, utiliza herramientas de análisis computacional para identificar posibles secuencias de ARN guía único dirigidas al gen seleccionado de interés. Selecciona secuencias ubicadas en exones lo más cerca posible del sitio de mutación deseado. Utiliza un explorador genómico para cruzar la estructura del exoma y priorizar las secuencias presentes en la mayoría de las isoformas de empalme.

Analiza la actividad fuera de objetivo prevista de cada secuencia guía utilizando el sistema integrado de puntuación de la herramienta. Elige secuencias que demuestren la menor probabilidad de unión fuera del objetivo. Para producir una plantilla lineal de ADN de doble hebra, se prepara la mezcla maestra PCR utilizando los componentes especificados en la tabla dada.

Añade la polimerasa al final y mantén la mezcla maestra sobre hielo para mantener la estabilidad enzimática. Luego, ejecuta la PCR usando las siguientes condiciones de ciclo térmico. A continuación, prepara la mezcla maestra de transcripción in vitro utilizando los componentes dados e incuba la reacción durante 1,5 horas a 37 grados Celsius usando un termociclador para un control de temperatura consistente.

Luego, añade dos microlitros de DNasa I a la reacción. Incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos adicionales para digerir la plantilla de ADN y luego inactivar la enzima a 75 grados Celsius durante cinco minutos. Tras la purificación de ARN por Trizol, se mide la concentración de ARN usando un espectrofotómetro y se comprueba las proporciones A260 a A280 y A260 a A230.

Para preparar el complejo ribonucleoproteico para la transfección, se diluye un molar de tampón de Tris-HCl a una concentración de 100 milimolares utilizando agua libre de nucleasa. Filtra la solución con un filtro de jeringuilla con un poro de 0,022 micrómetros. Ataliciar en porciones de 10 microlitros y guardarlas a cuatro grados Celsius hasta su uso.

A continuación, prepara la mezcla de transfección utilizando nucleasa spCas9, ARN guía simple y Tris-HCl diluidos con agua DEPC en un tubo libre de nucleasa. Incubar la mezcla de transfección a 37 grados Celsius durante 10 minutos para permitir la formación del complejo ribonucleoproteico. Luego, alicuota la mezcla de transfección en pequeños volúmenes adecuados para sesiones individuales de I-GONAD y mantenla a cuatro grados Celsius para preservar la actividad del reactivo.

Después de aparear a ratones hembras CD1 con machos CD1 de una sola casa durante la noche, comprueba que cada hembra tenga un tapón de cópula. Transfiere solo a las hembras con tapones visibles a una nueva jaula para procedimientos experimentales posteriores. Autoclave de todos los instrumentos quirúrgicos de acero inoxidable para asegurar la esterilidad antes de su uso.

Luego, pesa el plug seleccionado=ratones hembras positivos usando una báscula electrónica antes de anestesiarlos. Monitoriza a los ratones anestesiados para detectar la pérdida del reflejo de pellizco del dedo del pie para confirmar una anestesia adecuada. Coloca el ratón sobre una almohadilla eléctrica para mantener la temperatura corporal durante el procedimiento.

Luego, aplica pomada veterinaria en los ojos para evitar la sequedad. Con tijeras finas, realiza una incisión longitudinal de 0,7 centímetros en la piel de la zona lumbar. Luego, extiende lateralmente las puntas ligeramente abiertas de las tijeras para extender suavemente la incisión cutánea hasta aproximadamente 1,3 centímetros.

Después, haz cuidadosamente una incisión de 0,7 centímetros en el peritoneo para exponer la cavidad abdominal. Extiende la incisión peritoneal a 1,1 centímetros, empujando bilateralmente con las puntas de tijera ligeramente abiertas. Localiza la almohadilla grasa conectada al ovario y tira suavemente de ella hacia fuera usando pinzas hasta que el ovario, el oviducto y el útero queden expuestos.

Usando una pinza para vasos, asegura la almohadilla grasa para estabilizar las estructuras reproductivas. A continuación, carga dos microlitros de la mezcla de inyección de ribonucleoproteínas en un capilar plástico desechable usando una pipeta decapante. Con microtijeras, haz una incisión de 0,2 centímetros en la pared del oviducto unos milímetros aguas arriba de la ampolla.

Inserta el capilar plástico unido a la pipeta decapante en la incisión del oviducto y expulsa cuidadosamente la mezcla de inyección sin introducir aire. Retira suavemente el capilar plástico del oviducto para completar la inyección. Enciende el electroporador pulsando el interruptor de encendido en el panel frontal.

Configura los parámetros de electroporación del dispositivo tal como se muestra en la pantalla. Usando electrodos tipo pinza, agarra suavemente el oviducto y pulsa el botón Kiloohm para medir la resistencia. Inmediatamente después de la medición de resistencia, pulsa el botón de Inicio para iniciar la electroporación y espera a que aparezca la señal final en el botón Ohm.

Tras la electroporación del primer oviducto, devuelve suavemente el tracto reproductor a la cavidad abdominal. Cierra la incisión usando sutura quirúrgica con ácido poliglicólico 4-0. Para la genotipado, diseñar cebadores de 18 a 21 nucleótidos de longitud con una temperatura de fusión cercana a 60 grados Celsius para generar un producto PCR de 300 a 600 pares de bases.

Para confirmar la especificidad de cada cebador, realiza una búsqueda BLAST en la base de datos del genoma del ratón para eliminar el riesgo de amplificación inespecífica. A continuación, para la extracción de ADN, usando un perforador auricular, se recoge una pequeña muestra de tejido de aproximadamente dos milímetros de la oreja del ratón. Añade 100 microlitros de buffer de lisis.

Incubar la muestra a 95 grados Celsius durante 60 minutos, haciendo un vórtice cada 20 minutos para asegurar una lisis eficiente. Tras realizar la secuenciación de Sanger, analiza los resultados para evaluar los resultados de la edición genómica. Para utilizar el análisis ICE, sube ambos archivos de secuenciación de Sanger, introduce la secuencia de ARN guía y selecciona la nucleasa adecuada utilizada en el experimento CRISPR.

A continuación, para usar TIDE, sube los archivos de control y secuenciación experimental en formato AB1 e introduce la secuencia guía de ARN. El análisis ICE detectó tres variantes indel distintas en el sitio de corte Cas9: una eliminación de un par de bases en el 42% de las secuencias, una eliminación de tres pares de bases en el 25% de las secuencias y una eliminación de 23 pares de bases en el 27% de las secuencias. El valor de ajuste del modelo fue de 0,94 y la puntuación de knockout fue de 69, lo que indica una fuerte correlación predicha y probable knockout génico.

Los cromatogramas de secuencia confirmaron una alteración en el sitio de corte Cas9 en la muestra editada, mientras que el cromatograma de control mostró una secuencia intacta en el mismo sitio. De seis ratones electroporados, solo cuatro produjeron crías con mutaciones, lo que resultó en una eficiencia de edición global del 60%. Todas las camadas de los seis ratones electroporados mostraron un número reducido de crías, con solo tres o cuatro crías por ratón.