Mejora de la tecnología de vesículas extracelulares con receptor de antígeno quimérico (CAR-EV): el futuro de la terapia contra el cáncer

Nuestra investigación se centra en el desarrollo de diagnósticos y terapias basados en exosomas. Un objetivo es desarrollar terapias basadas en exosomas de receptores de antígenos quiméricos, que sean más seguras, más efectivas y accesibles que las terapias basadas en células, para el tratamiento de tumores secundarios. Nuestras plataformas EXO-NET y EXO-ACE permiten un aislamiento de exosomas escalable, reproducible y compatible con GMP con alto rendimiento y pureza, abordando las limitaciones de los métodos tradicionales para la investigación y la terapéutica.

EXO_NET red y EXO-ACE permiten un aislamiento de vehículos eléctricos rápido, escalable y compatible con GMP, con una pureza y reproducibilidad superiores, superando la centrifugación y la precipitación para aplicaciones de investigación, diagnóstico y terapéuticas. Hemos desarrollado un método rápido, escalable y validado para diseñar CAR-EV y ofrecer terapias específicas, libres de células y de próxima generación. Esto proporciona un flujo de trabajo sólido que se puede aplicar a otras afecciones de enfermedades donde existe una necesidad clínica.

Nuestro próximo objetivo es utilizar los métodos que hemos desarrollado y validado para generar CAR-EV para la administración de terapias de ARN para el tratamiento de tumores sólidos y otras enfermedades inflamatorias. Para comenzar, lleve la columna de intercambio iónico a temperatura ambiente dejándola reposar en posición vertical durante 15 minutos. Con una pipeta, agregue 10 volúmenes de columna de tampón de regeneración, seguidos de 10 volúmenes de columna de tampón de equilibrio.

Pasar el medio acondicionado THOD a través de un filtro de polietersulfona de 0,22 micrómetros. Ahora, agregue hasta 31,2 volúmenes de columna de la muestra filtrada en la columna equilibrada. Luego agregue 10 volúmenes de columna de tampón de lavado, seguidos de 2,5 volúmenes de columna de tampón de elución.

Recoger el flujo a través de la contención de las vesículas extracelulares enriquecidas. Utilizando filtros centrífugos de ultrafiltración de 30 kilodalton y un diluyente, realice el intercambio de tampones en el eluido de vesícula extracelular, asegurando una dilución mínima de 100 veces. Ajustar el volumen final de la solución intercambiada en función de las necesidades experimentales.

Pase la muestra de vesícula extracelular enriquecida a través de un filtro de 0,22 micrómetros para esterilizarla para ensayos in vitro. Determinar la distribución del tamaño, la concentración y el rendimiento de las vesículas extracelulares CAR mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas. Para el aislamiento de vesículas extracelulares panexosomas de alto rendimiento, enciéndalo e inicie sesión en el instrumento.

Configure los ajustes para establecer el protocolo de aislamiento de la proteína HT EV. Prepare una placa de peine de punta colocando un peine de punta en una placa de pocillos profundos de 96 pocillos. Agregue un mililitro de PBS en cada pocillo para preparar tres placas de lavado.

Ahora, prepare una placa de elución pipeteando 35 microlitros de tampón SDS al 1% en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Luego prepare una placa de unión agregando un mililitro del medio acondicionado. En el sistema de aislamiento automatizado, comience el protocolo seleccionando el programa HT EV Protein Isolation Protocol y seleccione el botón de reproducción.

Abra el instrumento para comenzar a cargar las placas. Siga las indicaciones del instrumento y cargue las placas de elución preparadas, seguidas de las placas de pocillos profundos de tres lavados en el instrumento. Justo antes de cargar la placa de unión, agregue 30 microlitros de perlas de captura de panexosomas en cada pocillo.

Cargue la placa de unión en el instrumento, luego cargue la placa de peine de punta y cierre el instrumento para iniciar la unión. El sistema mezclará la muestra de medio acondicionado y las perlas magnéticas de forma continua a baja velocidad durante 30 minutos, facilitando la captura eficiente de vesículas extracelulares. Una vez finalizado el paso de unión, permita que el sistema realice tres pasos de lavado, mezclando a baja velocidad durante 30 segundos para eliminar contaminantes no específicos.

Permita que el sistema automatizado inicie la lisis de vesículas extracelulares para la recuperación de proteínas realizando una mezcla de fondo de 30 segundos. Durante la incubación, el instrumento se detendrá durante siete minutos y 30 segundos, mientras mantiene las puntas de la pipeta colocadas sobre cada pocillo. Inicie otra mezcla de 30 = segundos, seguida de otra pausa de siete minutos y 30 segundos.

Cuando concluya el protocolo, el sistema levantará el peine de punta usado, dejando la solución en la placa de 96 pocillos y las perlas magnéticas unidas a las puntas. Finalmente, el instrumento procederá al paso de salida, devolviendo el peine de punta a la placa del peine de punta. Abra el instrumento y retire las placas.

La fluorescencia de GFP confirmó la expresión de CAR en células T transducidas, con localización evidente en grupos celulares y colocalización verificada mediante la superposición de canales de campo claro y GFP. El análisis de seguimiento de nanopartículas reveló una concentración significativamente mayor de vesículas extracelulares en la fracción EV enriquecida en comparación con los medios acondicionados para las construcciones EGFR y HER2 CAR. El Western blot confirmó la presencia de granzima B en las células que expresan CAR y en las vesículas extracelulares aisladas, con calnexina ausente en las vesículas extracelulares, lo que indica falta de contaminación celular.

Las vesículas extracelulares CAR dirigidas a EGFR redujeron significativamente la viabilidad de las células de cáncer de mama MCF-7 en un 70% y la viabilidad de las células de cáncer de sangre K-562 en un 40% Las vesículas extracelulares de CAR dirigidas a HER2 mostraron una reducción de aproximadamente el 10% en la viabilidad celular del cáncer de mama MCF-7, sin tener ningún efecto observable en las células cancerosas de sangre K-562.