Reprogramación intratable in vivo de células tumorales a células dendríticas convencionales tipo 1

Investigamos la programación in vivo de células cancerosas en células similares a cDC1 como una nueva estrategia de inmunoterapia. Nuestro objetivo es determinar si este enfoque puede convertir los tumores inmunes fríos en inmunes calientes, anunciando así la inmunidad antitumoral. Abordamos las limitaciones de las estrategias actuales de generación de cDC1 in vivo mediante la presentación de un protocolo para convertir las células cancerosas en células inmunogénicas similares a cDC1 directamente dentro del tumor, lo que permite el estudio de las respuestas inmunitarias impulsadas por cDC1 in situ.

Nuestro protocolo de programación in vivo manejable genera de manera confiable células inmunogénicas maduras similares a cDC1, superando el microambiente tumoral supresor y, debido a que estas células se generan directamente in vivo, este enfoque elimina la necesidad de fabricación de células inmunitarias in vitro. Nuestros hallazgos establecen una base para traducir la reprogramación mediada por factores de transcripción in vivo a la clínica, introduciendo inmunoterapia contra el cáncer lista para usar pero personalizada que provoca respuestas inmunitarias antitumorales duraderas. En el futuro, estamos investigando cómo la reprogramación de células similares a cDC1 puede provocar la formación de terciario e infraestructura y si esto se traduce en inmunidad humoral.

Además, también estamos explorando su posible sinergia con otros enfoques inmunoterapéuticos. Para comenzar, cultive las células HEK 293T hasta que alcancen entre un 70 y un 80% de confluencia. Ahora, agite la mezcla de transfección preparada que contiene el plásmido de transferencia durante un minuto e incube la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación del complejo lipídico de ADN.

Aspirar el medio de las células HEK 293T y añadir 10 mililitros de DMEM sin penicilina estreptomicina y suplementado con 10%FBS. Luego, agregue la mezcla de transfección gota a gota a las placas de 150 milímetros e incube durante 16 horas a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5%. Después de la incubación, reemplace el medio con 20 mililitros de medio completo de DMEM suplementado con un milimolar de butirato de sodio e incube las células durante 24 horas a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5%.

A continuación, recoja el sobrenadante que contiene lentivirus en un tubo cónico de 50 mililitros a las 48 y 60 horas después de la transfección. Después de la primera recolección, agregue 12 mililitros de DMEM completo precalentado por placa de 150 milímetros para la segunda cosecha. Filtre el líquido recolectado a través de un filtro de polietersulfona de baja unión a proteínas de 0,45 micrómetros.

Pipetee 37 gramos del medio que contiene lentivirus en tubos de polipropileno de pared delgada de 38,5 mililitros con la parte superior abierta. Centrifugar los tubos en un rotor de cubo oscilante a 25.000 G durante 90 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante sin alterar el sedimento.

Coloque los tubos de polipropileno de pared delgada con la parte superior abierta boca abajo sobre una toallita de laboratorio o material absorbente similar durante cinco minutos para drenar el exceso de líquido y secar el gránulo. A continuación, agregue 200 microlitros de DMEM helado suplementado con HEPES o PBS a cada gránulo y transfiera la mezcla a un tubo de microcentrífuga colocado en un tubo cónico de 50 mililitros. Incube el gránulo durante la noche a cuatro grados centígrados para permitir una resuspensión completa.

Combine todos los gránulos resuspendidos en un solo recipiente, alícuotas del caldo viral en volúmenes más pequeños entre 50 y 200 microlitros y guárdelo a menos 80 grados centígrados para su uso a largo plazo. Después de la expansión de las células cancerosas, prepare las suspensiones celulares para la transducción para lograr una proporción cercana a uno de células EGFP positivas a EGFP negativas en el tercer día. Agregue ocho microgramos por mililitro de polibeno a la suspensión celular, seguido del volumen apropiado de lentivirus, como se determinó anteriormente.

Mezclar el contenido suavemente sin generar burbujas. Ahora, pipetee dos mililitros de la suspensión celular preparada que contiene uno por 10 a la potencia de cinco células en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos e incube durante 24 horas a 37 grados Celsius con dióxido de carbono al 5%. Después de 24 horas, retire el medio que contiene lentivirus de cada pocillo.

Lave los pozos dos veces con PBS. Agregue 500 microlitros de tripsina a cada pocillo e incube durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5%. A continuación, examine los pocillos bajo un microscopio óptico para confirmar el desprendimiento completo de la célula de la placa.

Luego, recolecte las células con medios completos en tubos cónicos de 50 mililitros. Centrifugar las células durante cinco minutos a 350 G para granularlas. Lave el gránulo con PBS.

Tome una alícuota y evalúe el recuento de células viables con un hemocitómetro y tinción con azul de tripano. A continuación, vuelva a suspender el sedimento celular final en PBS helado para lograr una concentración de dos a cuatro veces 10 a la potencia de siete células por mililitro, lo que corresponde a uno o dos veces 10 a la potencia de seis células en 50 microlitros por tumor. Coloque las celdas en hielo y reubiquelas en el área de experimentación con animales.

Después de anestesiar al ratón CD45.1, colóquelo sobre una almohadilla térmica para evitar la hipotermia. Aplique crema para los ojos al ratón para prevenir la deshidratación ocular durante la anestesia. Con una navaja, afeite el flanco derecho del mouse.

Opcionalmente, marque el mouse con un cortaorejas. Desinfecte el área afeitada y elimine el vello restante con un hisopo humedecido en etanol al 70%. Ahora, con una pipeta P1000, vuelva a suspender las células cancerosas completamente.

Cargue la suspensión de celda completamente resuspendida en una jeringa de 0,5 mililitros equipada con una aguja de calibre 30. Levante suavemente la piel del flanco afeitado del ratón con dos dedos e inserte la punta de la aguja de la jeringa en el pliegue formado por la piel levantada. Suelte la piel levantada mientras sostiene la jeringa en su lugar con una mano.

Use la otra mano para estirar la parte superior de la piel con dos dedos. Inyecte lentamente 50 microlitros de la suspensión de células cancerosas para crear una hinchazón subcutánea visible de forma ovalada en el lugar de la inyección. Después del procedimiento de inyección, controle al animal hasta que se despierte por completo de la anestesia para garantizar su supervivencia.

Las células HEK 293T transfectadas con plásmido SFFV-PIB-eGFP mostraron una clara expresión de eGFP 24 horas después de la transfección, lo que confirma la administración exitosa de plasma. 72 horas después de la transducción, las células de melanoma indicaron una administración exitosa de los factores de reprogramación y eGFP. En el noveno día después de la implantación de las células, la reprogramación in vivo produjo un mayor porcentaje de células CD45 positivas para CD45, MHC-II, similares a cDC1 completamente reprogramadas que en condiciones in vitro.

Al tercer día después de la implantación, los tumores PIB-eGFP mostraron una infiltración de células inmunitarias CD45 CD45 positiva notablemente mayor que los controles de eGFP, lo que indica una remodelación inmune temprana. Para el día nueve, la intensidad media de fluorescencia de CD45 por área tumoral se mantuvo significativamente más alta en los tumores PIB-eGFP que en los controles. Las estructuras linfoides terciarias se volvieron detectables en los tumores PIB-eGFP al día nueve, lo que indica cambios inmunológicos estructurales en el microambiente tumoral.