Name: Reprogramación intratable in vivo de células tumorales a células dendríticas convencionales tipo 1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprende a reprogramar células tumorales a células dendríticas tipo 1 in vivo mediante factores de transcripción PU.1, IRF8 y BATF3 en modelos murinos. Este método convierte tumores fríos en calientes, potenciando la inmunidad antitumoral.

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<ol><li>Oliveira, G., Wu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+specificities+of+T+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dynamics and specificities of T cells in cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 23 (5), 295-316 (2023).</li>
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<li>Patel, M. R., Falchook, G. S., Hamada, K., Makris, L., Bendell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+2+trial+of+trifluridine%2Ftipiracil+plus+nivolumab+in+patients+with+heavily+pretreated+microsatellite-stable+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">A phase 2 trial of trifluridine/tipiracil plus nivolumab in patients with heavily pretreated microsatellite-stable metastatic colorectal cancer.</a> Cancer Med. 10 (4), 1183-1190 (2021).</li>
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<li>Hubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-III+is+selectively+produced+by+cDC1+and+predicts+good+clinical+outcome+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-III is selectively produced by cDC1 and predicts good clinical outcome in breast cancer.</a> Sci Immunol. 5 (46), eaav3942(2020).</li>
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<li>Ascic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+cell+reprogramming+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic cell reprogramming for cancer immunotherapy.</a> Science. 386 (6719), eadn9083(2024).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.45 &mu; m filtro de baja unión a proteínas, filtro de vacío con tapa de botella de 150 ml</td><td>Fisher científico</td><td>15983297</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol 50 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal CD45 anti-ratón (clon: 30-F11), IgG2b de rata, &kappa;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>B6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)</td><td>El laboratorio Jackson</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de insulina BD Micro-Fine U-100 (0,5 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11395751</td><td></td></tr><tr><td>Ratones C57BL/6J</td><td>El laboratorio Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Colador de células Corning Falcon para usar con tubos cónicos de 50 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS352340</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos Corning 24 x 50 mm&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS2975245</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>ADNasa I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Tinte de viabilidad fijable eFluor 450</td><td>Invitrogen</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Solución de recuperación de antígeno IHC - pH bajo (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-4955-58</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Fluoromount-G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo GFP [Alexa Fluor 594]</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-308AF594</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de DMEM/nutrientes F-12 de Gibco (DMEM/F-12)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Solución de aminoácidos no esenciales Gibco MEM (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>52400025</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Piruvato de Sodio (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano Gibco, 0,4%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H+L) anti-rata de cabra, policlonal, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>Células HEK 293T</td><td>ATTC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de hexadimetrina (polibreno)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con glucosa alta</td><td>Cytiva</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Solución de estreptomicina de penicilina HyClone 100x (pluma/estreptococo)</td><td>Cytiva</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato HyClone (PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Veterinario de ketaminol. Solución inyectable 100 mg/ml</td><td>MSD Salud Animal Suecia</td><td>QN01AX03</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de micrótomo - C35</td><td>PFM Médico</td><td>207500005</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-CD45.2 (104), Superficie, APC, Monoclonal</td><td>Bioleyenda</td><td>109814</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MHCII de ratón (M5/114.15.2), superficie, PE-Cy7, monoclonal</td><td>Bioleyenda</td><td>107630</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Suero de rata normal (estéril)</td><td>Abcam</td><td>AB7488</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de pared delgada abiertos</td><td>Ciencias de la vida de Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído, 16% p/v aq. soln., libre de metanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Modelo 043368.9M</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Batf3, un ratón monocistrónico que codifica casetes Batf3</td><td>Addgene</td><td>139837</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Irf8, un ratón monocistrónico que codifica casetes Irf8</td><td>Addgene</td><td>139838</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Pu.1, un casete monocistrónico que codifica Pu.1 de ratón</td><td>Addgene</td><td>139839</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido SFFV-eGFP (eGFP)</td><td>Clonación interna</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido SFFV-mCherry (mCherry)</td><td>Clonación interna</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido SFFV-PIB-eGFP,&nbsp; un casete policistrónico que codifica el ratón PU.1, IRF8 y BATF3 (PIB)&nbsp;</td><td>Clonación interna</td><td>-</td><td>Las construcciones y vectores utilizados para la reprogramación están disponibles en Asgard Therapeutics en virtud de un acuerdo de transferencia de material con la empresa</td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI), lineal, MW 25000, grado de transfección</td><td>Policiencias</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>ReadyProbes Pluma de Papanicolaou de barrera hidrofóbica</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R3777</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de adhesión SuperFrost Plus</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Compuesto Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x) sin rojo de fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>TT Cryomold Intermedio, cuadrado (15 x 15 x 5 mm)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Veterinario de Xysol. Solución inyectable 20 mg/ml</td><td>VM Pharma</td><td>QN05CM92</td><td></td></tr><tr><td>Celdas YUMM1.7</td><td>Antineo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

reprogramación intratable in vivo de células tumorales a células dendríticas convencionales tipo 1

Tractable In Vivo Reprogramming of Tumor Cells to Type 1 Conventional Dendritic Cell-like Cells

En la Figura 1 se presenta una descripción esquemática del protocolo de reprogramación in vivo manejable. Primero, producimos el vector lentiviral policistrónico SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP), que codifica para los factores de reprogramación de instrucción cDC1 PU.1, IRF8, BATF3, seguido de un sitio de entrada ribosómica interno (IRES) y una proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) en la línea celular de empaquetado HEK 293T. Para controlar la inmunogenicidad mediada por lentivirus, producimos un vector SFFV-MCS-eGFP vacío (eGFP), que contenía un sitio de clonación múltiple (MCS) e IRES-eGFP, pero excluyendo los factores de reprogramación. Después de la producción viral, cosechamos el sobrenadante que contenía lentivirus y lo concentramos por ultracentrifugación. Titulamos funcionalmente el virus para determinar la cantidad requerida para lograr una proporción de 1:1 de células transducidas (eGFP+) a no transducidas (eGFP-), que evaluamos el día 3 después de la transducción. Luego, usamos la cantidad de virus resultante para transducir la línea celular cancerosa seleccionada el día -1. Después de 24 h, recolectamos las células y las implantamos por vía subcutánea para establecer tumores. Esta estrategia aseguró que las células transducidas se reprogramaran en células similares a cDC1 in vivo, dentro del TME. En los puntos de tiempo indicados después del injerto, extirpamos y procesamos tumores para análisis posteriores, incluida la citometría de flujo de células tumorales disociadas, para cuantificar la eficiencia de reprogramación in vivo, o la tinción de inmunofluorescencia de secciones tumorales criopreservadas para caracterizar cambios en el TME.
En primer lugar, para garantizar la producción de altos títulos lentivirales, monitorizamos las células HEK 293T antes de la transfección, con el objetivo de alcanzar el 70-80% de confluencia y 24 h después, evaluamos la eficiencia de la transfección a través de la expresión de eGFP por microscopía de fluorescencia (Figura 2A). A continuación, recolectamos el medio que contenía virus 48 h y 60 h después de la transfección, lo ultracentrifugamos y lo almacenamos en alícuotas a -80 °C (Figura 2B). Luego, determinamos la cantidad viral óptima requerida para lograr una proporción de 1: 1 de células eGFP + a eGFP - en células de melanoma YUMM1.7. Sembramos 10 5células YUMM1.7 por pocillo en una placa de 6 pocillos, transducimos las células con volúmenes crecientes de lentivirus y reemplazamos el sobrenadante que contenía virus con medios completos frescos de DMEM / F12 después de 24 h (Figura 2C). El día 3, evaluamos la expresión de eGFP mediante microscopía de fluorescencia, antes de proceder a cuantificar los porcentajes precisos de células eGFP+ mediante citometría de flujo (Figura 2C). Para cuantificar la proporción de células eGFP+ a eGFP-, controlamos las células vivas individuales para excluir las células muertas y los dobletes (Figura 2D). El volumen óptimo del lote de lentivirus producido se determinó tanto para PIB-eGFP como para el virus eGFP de control como 2 μL por 10 5células YUMM1.7, lo que resultó en 50.0 ± 0.3% y 63.0 ± 0.9% de células eGFP+, respectivamente (Figura 2E).
A continuación, para evaluar la eficiencia de la reprogramación in vivo, generamos una línea celular de cáncer marcada con fluorescencia (mCherry +) (YUMM1.7-mCherry). Esto aseguró que pudiéramos discriminar entre células cancerosas y células estromales o inmunes mediante la activación de células mCherry + vivas en el análisis de citometría de flujo (Figura 3A, B). Luego transducimos células YUMM1.7-mCherry con 2 μL de PIB-eGFP o virus eGFP de control por 105 células para lograr una proporción de eGFP+ a eGFP- de 1: 1. Implantamos subcutáneamente 1,6 × 106 células por tumor en ratones CD45.1 y mantuvimos una alícuota de células para cultivar in vitro para comparar. Evaluamos la eficiencia de reprogramación mediante citometría de flujo, activando células vivas mCherry + eGFP + y CD45.1- para excluir las células inmunes del huésped que han engullido eGFP o mCherry (Figura 3B). De los días 1 a 9, observamos la adquisición gradual de la expresión de CD45.2 y/o MHC-II, marcando células similares a cDC1 parcialmente reprogramadas (CD45.2+ MHC-II- o CD45.2- MHC-II+) y células similares a cDC1 completamente reprogramadas (CD45+ MHC-II+) (Figura 3C). Validamos que la reprogramación de células cancerosas de ratón in vivo dio como resultado porcentajes más altos de células similares a cDC1 en el día 9 en comparación con las condiciones in vitro (9,54 ± 1,54% CD45+ MHC-II+ in vivo frente a 4,72 ± 1,1% CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,018). La cinética de la reprogramación también se aceleró ya que observamos un mayor porcentaje de células similares a cDC1 ya en el día 4 (8,7 ± 3,3% CD45+ MHC-II+ in vivo vs. 0,3 ± 0,1% CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,05), lo que indica que la presencia de señales ambientales promueve una reprogramación más rápida y eficiente hacia células similares a cDC119. Mientras que las células similares a cDC1 reprogramadas in vitro estuvieron presentes hasta el día 15, las células similares a cDC1 in vivo persistieron durante 9 días, pero no se detectaron el día 15, lo que sugiere el agotamiento del TME por parte del sistema inmunológico del huésped (Figura 3C). 
Por último, nuestro objetivo fue caracterizar los cambios tempranos del TME como resultado de la reprogramación in vivo de cDC1 en los primeros 9 días. Realizamos tinción de inmunofluorescencia de tejidos tumorales criopreservados y seccionados de tumores eGFP y PIB-eGFP después de 3 y 9 días de reprogramación in vivo , centrándonos en la infiltración de células inmunes marcadas por el marcador panhematopoyético CD45. En particular, las células similares a cDC1 reclutaron significativamente más células CD45 para el TME fácilmente el día 3, en comparación con los tumores eGFP (49,6 ± 17,0 frente a 8,0 ± 5,8 eGFP intensidad de fluorescencia media de la tinción CD45 por área tumoral; Figura 4A, B). Curiosamente, detectamos TLS dentro del TME de tumores después de 9 días de reprogramación in vivo . Esto sugiere que las células similares a cDC1 pueden remodelar rápidamente el TME de un ambiente "inmunofrío" a un ambiente "inmune-caliente" en 3 días, lo que posteriormente conduce a la formación de TLS en el día 9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig1.jpg"> 
Figura 1: Descripción general del protocolo para generar células similares a cDC1 mediante la reprogramación in vivo de células cancerosas. Los vectores lentivirales que codifican PU.1, IRF8 y BATF3 en un casete policistrónico bajo el control del promotor del virus formador de focos del bazo (SFFV) y eGFP después de un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) para rastrear células transducidas mediante citometría de flujo y microscopía de fluorescencia, se producen en la línea celular de empaquetado HEK 293T. Luego, los vectores lentivirales se ultracentrifugan y se titulan funcionalmente para determinar la cantidad de virus necesaria para transducir las células cancerosas en una proporción de eGFP+ transducida 1:1 a células eGFP- no transducidas. Para experimentos de reprogramación in vivo , las células cancerosas se siembran con la cantidad óptima de lentivirus en el día -1. Al día siguiente, esta mezcla 1:1 de células GFP+ transducidas y GFP- no transducidas se lava y se recolecta para el establecimiento de tumores subcutáneos en ratones. Se mantienen cultivos in vitro paralelos para validar la transducción en el día 3 mediante citometría de flujo. Los animales son monitoreados cada 2-3 días para determinar el crecimiento y la supervivencia del tumor. Los tumores se recolectan en puntos temporales definidos, se disocian y se tiñen para la expresión de marcadores de superficie para el análisis de citometría de flujo. Alternativamente, los tejidos completos se fijan, se criopreservan y se seccionan para la tinción de inmunofluorescencia y el análisis de microscopía confocal. La eficiencia de la reprogramación in vivo se evalúa mediante análisis de citometría de flujo, mientras que los cambios en el microambiente tumoral se caracterizan mediante imágenes confocales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig2.jpg"> 
Figura 2: Producción y titulación funcional de lentivirus para la reprogramación in vivo de cDC1. (A) Cuando las células HEK 293T alcanzan una confluencia de ~70-80%, se transfectan con una mezcla que contiene 10 μg de plásmido de transferencia SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP) o SFFV-eGFP de control de vectores lentivirales vacíos (eGFP), junto con 7,5 μg de psPAX2 y 2,5 μg de mPD2.G y 60 μL de 1 mg/mL de PEI. Imágenes de microscopía de campo claro y fluorescencia de células HEK 293T que muestran la expresión de eGFP 24 h después de la transfección, lo que indica una administración exitosa del plásmido. Barras de escala = 200 μm. (B) Representación esquemática del flujo de trabajo de ultracentrifugación para concentrar lentivirus. El sobrenadante que contiene lentivirus de células HEK 293T se recolecta 48 h y 60 h después de la transfección, se filtra a través de un filtro PES de baja unión a proteínas de 0,45 μm y se pesan 37 g en tubos de polipropileno de pared delgada de parte superior abierta utilizando una báscula de sobremesa. Los tubos se ultracentrifugan en un rotor de cubeta oscilante, se aspira el sobrenadante y se seca el pellet durante 5 min. Luego, los gránulos se resuspenden en DMEM helado que contiene HEPES y se incuban durante la noche antes de alícuotas y almacenamiento a -80 ° C. (C) Estrategia experimental de la titulación funcional para determinar la dosis viral óptima para lograr una proporción de 1: 1 de GFP + a células GFP-. Imágenes de microscopía de campo claro y fluorescencia que muestran la expresión de eGFP en células de melanoma YUMM1.7, 72 h después de la transducción, lo que indica la administración exitosa de los factores de reprogramación y eGFP. Barras de escala = 100 μm. (D) Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran la estrategia de activación para cuantificar la proporción de células eGFP+ . Las células vivas se cerraron para la población negativa de colorante de viabilidad (DAPI) seguida de la exclusión del doblete. (E) Cuantificación por citometría de flujo de la eficiencia de la transducción con dosis virales crecientes para determinar el volumen óptimo para lograr células GFP+/GFP- 1:1. Tanto para el lentivirus PIB-eGFP como para el eGFP, un volumen de 2 μL por 105 células logró la proporción deseada. Abreviaturas: cDC1s = células dendríticas convencionales tipo 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; PIB = PU.1, IRF8 y BATF3; PEI = polietilenimina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig3.jpg"> 
Figura 3: Evaluación de la eficiencia de reprogramación de cDC1 in vivo. (A) Representación esquemática del flujo de trabajo experimental para evaluar la eficiencia de reprogramación de cDC1 in vivo. Las células cancerosas se transducen inicialmente con un lentivirus que expresa mCherry para generar una línea celular marcada con fluorescencia (YUMM1.7-mCherry), seguida de la transducción con la dosis optimizada de lentivirus PIB-eGFP en el día -1. Luego, las células se inyectan por vía subcutánea con una proporción de 1: 1 de células eGFP + / eGFP - en el día 0 para establecer tumores en ratones CD45.1 y permitir que las células transducidas por PIB se reprogramen en células similares a cDC1 dentro del TME. Luego, los tumores se aíslan en los puntos de tiempo indicados, se disocian y se tiñen para CD45.1, CD45.2 y MHC-II mediante citometría de flujo. Esto permite la exclusión de las células inmunitarias del huésped CD45.1 para cuantificar la eficiencia de reprogramación de cDC1 in vivo mediante la expresión de CD45.2 y MHC-II. Los cultivos in vitro paralelos se mantienen a lo largo de los puntos de tiempo como una comparación con la reprogramación in vivo. (B) Gráficos representativos de citometría de flujo que ilustran la estrategia de activación en el día 9. Las células se cerraron en mCherry + y GFP + para identificar células cancerosas transducidas con éxito. Las células inmunitarias del huésped se excluyeron mediante la eliminación de las células CD45.1+. (C) Cuantificación de la eficiencia de reprogramación in vivo (izquierda) de células YUMM1.7-mCherry mediante citometría de flujo como el porcentaje de células CD45+ MHC-II+ (completamente reprogramadas) y células CD45.2+ HLA-DR- o CD45.2- HLA-DR+ similares a cDC1 (parcialmente reprogramadas) activadas dentro de eGFP+ mCherry+ células. Gráficos representativos de citometría de flujo (derecha) que muestran la adquisición gradual de la expresión de CD45.2 y MHC-II en células YUMM1.7-mCherry transducidas por PIB-eGFP a lo largo de los puntos de tiempo indicados. Se utilizaron células YUMM1.7-mCherry transducidas por eGFP como control y se utilizaron células similares a cDC1 reprogramadas in vitro para la comparación. Los datos en (C) indican la media ± DE de 3-5 experimentos biológicos replicados. El análisis estadístico en (C) se realizó para las células CD45+ MHC-II+ utilizando la prueba de Mann-Whitney. *P &lt; 0,05. Abreviaturas: cDC1s = células dendríticas convencionales tipo 1; PIB = PU.1, IRF8 y BATF3; TME = microambiente tumoral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig4.jpg"> 
Figura 4: Análisis de la infiltración inmune en el microambiente tumoral después de la reprogramación in vivo de cDC1. (A) Imágenes confocales representativas que muestran células CD45+ en tumores YUMM1.7 después de la implantación subcutánea de células transducidas por PIB-eGFP o eGFP de control (proporción 1:1 de células transducidas a células parentales) en los días 3 y 9. Barras de escala = 500 μm. (B) Cuantificación del MFI para la tinción de CD45 en tumores YUMM1.7 tratados con PIB y transducidos por eGFP en los días 3 y 9. Los datos en (B) indican la media ± DE de 3-6 experimentos biológicos replicados. El análisis estadístico en (B) se realizó mediante la prueba de Mann-Whitney. *P &lt; 0,05 y ***P &lt; 0,001. Abreviaturas: cDC1s = células dendríticas convencionales tipo 1; PIB = PU.1, IRF8 y BATF3; MFI = intensidad media de fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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