Desarrollo de líneas de organoides derivados de ratones a partir de células epiteliales de trompas de Falopio para el modelado de carcinoma de ovario seroso de alto grado

Así que sí, actualmente estamos trabajando en el desarrollo de modelos novedosos de carcinoma seroso de ovario de alto grado, modelos que son singénicos en el sentido que describe el protocolo. Tomamos las trompas de Falopio sanas de ratones sanos y luego las derivamos como organoides en la placa de Petri y les damos todos los diferentes errores o modificaciones genéticas que normalmente encontraríamos en una versión humana normal de la enfermedad. Esto es muy interesante porque, por un lado, puedes estudiar todo tipo de factores intrínsecos de estos tumores dentro de la placa de Petri como organoides, que son más realistas que los cultivos tradicionales en 2D.

Pero la cuestión es que, dado que existen modelos singénicos, puedes tomar estos organoides y volver a ponerlos en un ratón, y ver cómo se desarrolla el tumor y cómo interactúa con el huésped. Esto nos permite tener una visión mucho más holística de cómo ocurre realmente un tumor y la tumorogénesis, lo que esperamos nos proporcione mejores herramientas y una comprensión mucho mejor de cómo funciona esta enfermedad y cómo combatirla mejor. Para empezar, obtén ratones negros C57 6J eutanasiados.

Extrae el ovario y la trompa de Falopio y transfiere a una placa de Petri estéril que contenga DMEM, suplementada con penicilina estreptomicina a cuatro grados Celsius. Utiliza un microscopio de disección, pinzas finas y tijeras para eliminar la grasa residual del ovario. Aislar la trompa de Falopio, incluyendo el infundíbulo y parte de la ampolla distal, del ovario y el útero.

Ahora transfiere el tejido limpio a un tubo que contiene la mezcla digestiva completa. Con unas tijeras finas, tritura la trompa de Falopio en pedazos menores de 0,5 milímetros. Luego incubar el tubo a 37 grados Celsius durante 40 a 50 minutos antes de realizar el cultivo de organoides.

Para desarrollar el modelo tumoral de ratón, se preparan cinco inyecciones, cada una con cuatro millones de células resuspendidas en Opti-MEM I sin suplemento, una matriz de membrana basal helada. Para preparar las inyecciones, primero se expulsan las burbujas de aire del volumen muerto de una jeringuilla de insulina U-100 equipada con una aguja calibre 28 usando PBS en frío. Luego carga lentamente la jeringuilla con 40 microlitros de células y mantén las jeringuillas cargadas en hielo hasta que los ratones estén anestesiados.

Una vez lista para la inyección, coloque las jeringuillas junto a una lámpara calefactante para permitir que la matriz de membrana del baso se caliente y aumente la viscosidad, facilitando la inyección y el enjertamiento. A continuación, coloca un ratón en una jaula precalentada bajo una lámpara térmica para prepararte para la cirugía. Haz una incisión de menos de un centímetro a lo largo del flanco, por encima del muslo de un ratón anestesiado.

Corta la epidermis y la hipodermis para llegar a la zona bursa. Saca suavemente el ovario localizando la almohadilla grasa adherida. Luego, usando una jeringuilla preparada, inyecta las células a través de la almohadilla grasa y el ovario en el saco del oviducto.

Devuelve cuidadosamente el ovario a la bursa. Cierra la capa muscular usando suturas no trenzadas. Posteriormente, cierra la incisión cutánea usando grapas quirúrgicas.

Vuelve a colocar el ratón en la jaula calentada y mantén la temperatura corporal con una lámpara de calor hasta que esté semiconsciente, normalmente durante más de 15 minutos. Los organoides derivados del epitelio de la trompa de Falopio murino tienen una forma esférica bien definida y clara tras unos cinco días, y requieren envasado entre el día 10 y el 12. Los organoides de tipo salvaje se transforman en tumoroides precancerosos mediante técnicas de ingeniería genética, como la sobreexpresión génica lentiviral o retroviral.

Las líneas celulares clonadas individuales derivadas de los organoides genéticamente modificados pueden estudiarse aún más in vivo mediante la inyección en la bursa ovárica. Los tumores suelen alcanzar un tamaño de dos a tres centímetros alrededor de los 60 días tras la inyección. Bueno, decimos que, como he indicado antes, la mayor ventaja de que, ya sabes, la forma en que funciona este protocolo, por supuesto, es generar estos modelos singénicos, ¿verdad?

Y como son singéneos, como dije antes, puedes apreciar toda la interacción entre, ya sabes, un animal completo, un ratón completo, y el tumor que estás desarrollando mientras tienes, ya sabes, control total sobre la genética del tumor. Así que, por supuesto, comparado con otros modelos donde quizá se intente entender el sistema inmunitario dentro de la placa de Petri, será muy difícil replicar el sistema inmunitario en la placa de Petri. O si tomas PDX, como muestras, muestras de tumores de pacientes que luego se aplican en ratones, para que funcione, los ratones no pueden tener sistema inmunitario o si no rechazarán este tumor, ¿verdad?

Pero dado que este modelo es singénico, se puede apreciar realmente toda la interacción del huésped completo con el tumor y, en particular, con el sistema inmunitario, que ahora mismo es una de las áreas de investigación más candentes en el campo. Así que realmente creo que ese es el beneficio más importante de este protocolo comparado con otros protocolos que se encuentran en otros lugares. Así que, de hecho, ya hemos estado usando estos modelos para investigar algunos fenómenos muy interesantes.

Diría que lo que más me interesa ahora mismo es cómo el sistema inmunitario adaptativo, por lo que hemos visto, parece ser un factor clave en la configuración de las propiedades genómicas, especialmente las variaciones de número de copias de carcinomas serosos de ovario de alto grado, en el sentido de que si el sistema inmunitario no está presente, parece que estos tumores no desarrollan reordenamientos tan masivos y complejos del ADN. Así que intentamos averiguar cómo ocurre esto y cómo, con suerte, podríamos intentar revertirlo para potenciar cualquier tipo de terapia inmunitaria contra ello.