Optimización rápida de un sistema inducible por luz para controlar la expresión génica de mamíferos

Este proyecto tiene como objetivo desarrollar un método de alto rendimiento para optimizar y caracterizar una herramienta optogenética multicomponente llamada LACE para la expresión génica en mamíferos. Para empezar, coloca un matraz de cultivo celular que contiene células T HEK 293 dentro de un armario de bioseguridad. Utiliza una pipeta serológica para aspirar el medio gastado.

Pipetear 10 mililitros de DPBS en una esquina del matraz y girar suavemente para lavar las celdas. Luego aspira la solución de lavado y tira tanto el DPBS como el aspirador en el contenedor de residuos. Ahora añade 1,5 mililitros de tripsina-EDTA al 0,05% al matraz para cubrir la superficie e incubar.

Golpea suavemente el matraz para aflojar las células de la superficie. A continuación, introduce 8,5 mililitros de DMEM fresco en el frasco. Aspira la solución arriba y abajo hasta que no haya agregados visibles para volver a suspender las células.

Luego transfiere nueve mililitros de la suspensión de la celda a un tubo cónico de 15 mililitros. Añade nueve mililitros de DMEM fresco al frasco. Incubar la suspensión hasta que confluya por debajo del 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius.

Ahora, mezcla 10 microlitros de las células suspendidas con 10 microlitros de tinte tripsina en una proporción uno a uno para calcular la concentración celular usando un hemocitómetro. Siembra aproximadamente 35.000 células en 100 microlitros en cada pozo de una placa negra de alto rendimiento, número 1,5, de 96 pozos, con fondo de cristal. Coloca la placa en una incubadora a 37 grados Celsius y al 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.

Para la transfección, primero se ponen 11 microlitros de DMEM caliente sin suero en un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros para un pozo y un 10% de excedente. Preparar diversas proporciones de masa plasmídica de la proteína fluorescente verde mejorada con CRY2 para ARN guía CIBN/110 nanogramos por pozo de las soluciones preparadas en cada tubo que contenga las alícuotas del medio libre de suero. Luego se pipetean 11 microlitros adicionales de DMEM sin suero para cada pozo en tubos separados para la dilución del reactivo de transfección.

Añade el reactivo de transfección diluido a la mezcla del medio de ADN e incuba para formar los complejos de transfección. Luego se pipeta 20 microlitros del complejo de transfección preparado a cada pozo de la placa de 96 pozos que contiene las células T HEK 293. Envuelva la placa de 96 pozos en papel de aluminio y colócala en una incubadora a 37 grados Celsius bajo un 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.

Para iniciar el proceso de activación, modifica el código de entrada del microcontrolador para iluminar los pozos deseados usando las líneas de script especificadas. Ajusta la intensidad del diodo emisor de luz a 9,27 milivatios por centímetro cuadrado usando las líneas de código indicadas. Ajusta la duración del pulso a un segundo y luego ajusta la frecuencia del pulso a 0,067 hertzios, equivalente a cada 15 segundos.

Rocía la tapa impresa en 3D del optoPlate con etanol al 70%. Luego déjalo secar en un armario de bioseguridad. Ahora, enciende una lámpara de luz roja en el cuarto oscuro.

Coloca la placa de 96 pozos en el armario de bioseguridad. Cambia la tapa del plato por la tapa seca impresa en 3D. Coloque la placa de 96 pozos sobre la matriz LED para ensamblar el aparato de activación.

Coloque el aparato de matriz LED completamente ensamblado en una incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Conecta el microcontrolador, el diodo emisor de luz y los puertos del ventilador a una fuente de alimentación. Para realizar citometría de flujo, ejecuta el programa de inicio del sistema en el software experto del sitio.

Carga dos mililitros de agua desionizada en el cargador de muestras. Realiza el control de calidad usando las cuentas de control de calidad proporcionadas. Configurar y especificar los pozos de muestreo para la adquisición.

Crea los gráficos y tablas para dispersión lateral frente a la dispersión directa, altura de dispersión lateral frente a área de dispersión lateral, área de dispersión lateral frente a FITC-A y la tabla estadística de FITC-A. Ahora, acopla la placa de 960 pozos en V inferior al cargador de placas del citómetro. Selecciona un pozo sin transfectar y haz clic en Inicializar, seguido de Ejecutar.

Ajusta los voltajes de dispersión lateral y FITC para centrar la población de interés en el gráfico SSC-A frente al FSC-A. Haz clic en Ejecutar y luego selecciona una proteína fluorescente verde mejorada con CMV bien transfectada. Ajusta el voltaje FITC para incluir tanto las células autofluorescentes como las fluorescentes en el gráfico SSC-A frente al FITC-A.

Crea un polígono para bloquear la población celular sana. Un segundo polígono para la compuerta para discriminar dobletes en el gráfico SSC-H frente al SSC-A. Crea una puerta de polígonos para distinguir las células fluorescentes de las que no fluorescen usando la puerta de las células no transfectadas como referencia.

Graba automáticamente muestras a 60 microlitros por minuto hasta que hayan transcurrido 200 segundos o se alcancen 10.000 eventos. Luego exporta los valores medios de FITC como un archivo CSV y analiza los datos. Limpia el citómetro de flujo seleccionando la opción de limpieza diaria.

La imagen de fluorescencia mostró que a una relación de masas de uno a nueve la activación de la luz azul inducía una menor expresión máxima de eGFP en comparación con la proporción de cinco a cinco, que también mostraba mayor permeabilidad en la oscuridad. La citometría de flujo mostró que más del 95% de los eventos con puertas en P1 fueron singlets en todas las condiciones. Y las células no transfectadas tenían menos del 0,1% de población positiva para eGFP.

El control de CMV-eGFP tuvo aproximadamente un 99% de células positivas para eGFP, mientras que las células transfectadas con 2pLACE tuvieron aproximadamente un 57%. Las células transfectadas con CMV-eGFP mostraron una fuerte expresión constitutiva de eGFP tanto en condiciones de luz como de oscuridad, mientras que las células no transfectadas no mostraron fluorescencia visible. También confirmó la transfección exitosa de 2pLACE y la activación de la expresión de eGFP bajo luz azul con menor expresión que la CMVeGFP. Se observó un triplicado aumento en la expresión de eGFP en muestras de 2pLACE activadas por luz en comparación con condiciones oscuras.

El porcentaje de células positivas para eGFP en muestras transfectadas con 2pLACE fue aproximadamente del 60%. La relación de masas de tres a siete produjo la mayor intensidad media de fluorescencia y rango dinámico. Este protocolo permite la evaluación de alto rendimiento de muestras y la replicación técnica usando el optoPlate para programar condiciones de luz y frecuencias de pulso variables.